靶向NS3的抗登革病毒小分子抑制剂的发现及作用机制研究

发布时间：2017-04-10 08:00

  本文关键词：靶向NS3的抗登革病毒小分子抑制剂的发现及作用机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：登革病毒(Dengue virus,DENV)是一类在热带与亚热带地区广泛流行的病原体,其与黄热病毒(YFV),乙型脑炎病毒(JEV)和西尼罗河病毒(WNV)等同属于黄病毒属家族。登革病毒包括DENV-1,DENV-2,DENV-3,DENV-4四种血清型,其中以DENV-2最为流行。人感染其中任意一型登革病毒均会导致一系列严重的传染疾病,如登革热(Dengue fever,DF),登革出血热(Dengue hemorrhagic fever,DHF)以及登革热休克综合征(Dengue shock syndrome,DSS)。目前,全球热带及亚热带地区每年大约有3.9亿人被登革病毒感染,其中9600万人因此患病。截止目前为止人们尚未研制出有效的抗登革病毒药物,此外疫苗的开发也由于登革病毒本身具有的抗体依赖性感染增强作用(Antibody dependent enhancement,ADE)变得异常艰难。因此,寻找开发出一种新的有效抗登革病毒药物迫在眉睫。非结构蛋白3(Non-structural protein 3,NS3)是登革病毒所编码的一种极为重要的蛋白,其N端是一种具有丝氨酸蛋白酶催化三联体结构的类胰蛋白酶。NS3主要参与登革病毒编码的前体蛋白剪切,这对病毒的成熟以及复制均十分关键。NS3的蛋白酶活性需要在NS2B的存在时才能被激活,作为辅因子的NS2B可以将NS3的酶活力提高3300-6600倍。由于复合蛋白NS2B/NS3pro(NS2B/NS3 protease)对登革病毒成熟以及复制起着至关重要的作用,目前其已成为一个重要的抗登革病毒药物开发靶点。因此,NS2B/NS3pro的抑制剂的发现与作用机制研究具有十分重大的意义。本课题通过将p ET15b-DENV-2-NS2B/NS3重组质粒转化至Escherichia coli BL21(DE3)中进行诱导表达NS2B/NS3pro;采用镍柱亲和层析法得到高纯度的NS2B/NS3pro;利用高通量筛选平台对实验室现存化合物库进行NS2B/NS3pro抑制剂的筛选;并用MTT比色法检测NS2B/NS3pro候选抑制剂的细胞毒性;同时采用病毒复制子抑制实验评价候选化合物对DENV-2病毒复制的抑制效果;最后综合利用酶动力学,表面等离子共振技术,差式扫描量热法,紫外光谱法,分子模拟对接以及蛋白质定点突变等技术方法原理对化合物抑制NS2B/NS3pro蛋白酶活性机制进行研究,结果表明:NS2B/NS3pro抑制剂(化合物MT02A3101)具有极低的细胞毒性同时表现出良好的抑制登革病毒复制活性;MT02A3101作为一个NS2B/NS3pro的竞争性抑制剂与NS2B/NS3pro底物结合口袋存在强烈的结合同时使NS2B/NS3pro的热稳定性下降从而抑制其蛋白酶活性;此外还发现MT02A3101与NS2B/NS3pro的106位Gln,114位Gln,132位Thr及133位Arg生成氢键,同时与109位Ile,115位Ile及131位Val存在疏水作用。
【关键词】：登革病毒 NS2B/NS3pro抑制剂 作用机制 结合模型
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373.33
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 缩略语表8-13
• 第一章 绪论13-20
• 1.1 登革病毒概述13-14
• 1.2 登革病毒蛋白14-16
• 1.2.1 结构蛋白14-15
• 1.2.2 非结构蛋白15-16
• 1.3 登革病毒抑制剂16-19
• 1.3.1 病毒进入阻断剂16-17
• 1.3.2 宿主相关因子抑制剂17
• 1.3.3 抗病毒核苷酸17-18
• 1.3.4 多聚酶抑制剂18
• 1.3.5 蛋白酶抑制剂18-19
• 1.4 本课题研究目的和意义19-20
• 第二章 登革病毒NS2B/NS3pro的表达纯化20-26
• 2.1 引言20
• 2.2 实验材料、试剂与仪器20-22
• 2.2.1 实验材料20
• 2.2.2 试剂20-21
• 2.2.3 实验仪器21
• 2.2.4 相关溶液配制21-22
• 2.3 实验方法22-24
• 2.3.1 感受态制备22
• 2.3.2 重组质粒转化22
• 3.3.3 NS2B/NS3pro表达22
• 3.3.4 镍离子亲和层析柱处理22-23
• 3.3.5 NS2B/NS3pro纯化23
• 3.3.6 NS2B/NS3pro活性检测23-24
• 2.4 结果24-25
• 2.4.1 NS2B/NS3pro表达纯化结果24
• 2.4.2 NS2B/NS3pro酶活性检测结果24-25
• 2.5 讨论25-26
• 第三章 登革病毒NS2B/NS3pro抑制剂的发现及评价26-31
• 3.1 引言26
• 3.2 实验材料、试剂与仪器26-27
• 3.2.1 实验材料26
• 3.2.2 试剂26
• 3.2.3 仪器26
• 3.2.4 相关溶液配制26-27
• 3.3 实验方法27-28
• 3.3.1 NS2B/NS3pro抑制剂的筛选及IC50测定27
• 3.3.2 NS2B/NS3pro抑制剂的细胞毒性测试27
• 3.3.3 NS2B/NS3pro抑制剂的抗病毒活性测定27-28
• 3.4 结果28-29
• 3.4.1 NS2B/NS3pro抑制剂及其IC5028
• 3.4.2 NS2B/NS3pro抑制剂的细胞毒性28
• 3.4.3 NS2B/NS3pro抑制剂的抗病毒活性28-29
• 3.5 讨论29-31
• 第四章 登革病毒抑制剂的作用机制研究31-43
• 4.1 引言31
• 4.2 实验材料、试剂与仪器31-32
• 4.2.1 实验材料31
• 4.2.2 试剂31
• 4.2.3 仪器31
• 4.2.4 相关溶液配制31-32
• 4.3 实验方法32-36
• 4.3.1 抑制剂类型测定32
• 4.3.2 紫外可见光谱实验32
• 4.3.3 表面等离子共振实验32-33
• 4.3.4 差式扫描量热实验33-34
• 4.3.5 分子模拟对接分析34-35
• 4.3.6 蛋白质定点突变分析35-36
• 4.4 结果36-42
• 4.4.1 MT02A3101为NS2B/NS3pro的竞争性抑制剂36
• 4.4.2 MT02A3101与NS2B/NS3pro存在直接的相互作用36-38
• 4.4.3 MT02A3101降低NS2B/NS3pro的稳定性38
• 4.4.4 MT02A3101与NS2B/NS3pro的结合模型38-42
• 4.5 讨论42-43
• 第五章 结论与展望43-44
• 5.1 结论43
• 5.2 展望43-44
• 参考文献44-48
• 致谢48

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 金一;余传信;;蛋白质及多肽类药物长效化研究进展[J];中国血吸虫病防治杂志;2012年05期

  本文关键词：靶向NS3的抗登革病毒小分子抑制剂的发现及作用机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：296226