反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌八种药物耐药性的研究

发布时间：2017-04-10 09:15

  本文关键词：反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌八种药物耐药性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：耐药结核病尤其是耐多药结核病(multi-drug resistant tuberculosis,MDR-TB,)及广泛耐药结核病(extensively drug resistant tuberculosis,XDR-TB,)的出现和流行成为了全球重点关注的公共卫生问题及社会问题。长期以来,以细菌培养为基础的传统药敏试验被视为金标准广泛应用于临床,但其耗时长,结核病患者在初期得不到及时有效的治疗而延误病情。新兴的分子生物学方法在部分一线抗结核药物中已经取得了良好的检测效果,几乎可以与表型药敏试验相媲美,但它们需要特殊的仪器试剂,且在二线药物检测中应用较少。而反向斑点杂交(Reverse dot blot hybridization,RDBH)是一种基于基因扩增上的分子杂交技术,具有快速、简便、高效、直观等特点。本研究旨在建立一种能同时检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)对四种一线和四种二线抗结核药物耐药性的RDBH技术,以实现耐药结核病的全面快速检测,为有效防治耐药结核病提供新的技术手段。分别针对结核分枝杆菌八种药物,包括四种一线抗结核药抗结核药异烟肼(Isoniazid,INH)、利福平(Rifampicin,RIF)、链霉素(Streptomycin,SM)、乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)和四种二线抗结核药氧氟沙星(Ofloxacin,OFX)、卡那霉素(Kanamycin,KAN)、阿米卡星(Amikacin,AMK)、卷曲霉素(Capreomycin,CPM),主要耐药相关基因及常见的突变位点,设计合成46条氨基标记的特异性寡核苷酸探针。通过小样本试验优化RDBH技术条件,建立RDBH技术,并对326株和170株MTB临床分离株分别进行一线、二线抗结核药物耐药性检测,采用比例法药敏试验和DNA测序结果作对照,初步评价该技术的检测效能。经过实验条件的反复优化,最终确定了探针序列、探针终浓度为0.5?M、杂交盐离子浓度为5×SSPE/0.1%SDS、最适杂交温度60℃、洗膜温度50℃、POD-TMB为显色体系。同时应用比例法药敏试验、DNA测序和RDBH技术分别对326株和170株MTB临床分离株进行了INH、RIF、SM、EMB四种一线抗结核药物和OFX、KAN、AMK、CPM四种二线抗结核药物的耐药性检测,以比例法作参照,RDBH检测INH、RIF、SM、EMB、OFX、KAN、AMK和CPM的敏感度分别为84.5%(185/219)、86.5%(166/192)、72.3%(120/166)、55.4%(51/92)、62.8%(59/94)、56.0%(14/25)、61.5%(8/13)和45.0%(9/20);特异度分别为95.3%(102/107)、95.5%(128/134)、91.3%(146/160)、82.1%(192/234)、100.0%(76/76)、100.0%(145/145)、98.7%(155/157)和99.3%(149/150);Kappa值分别为0.75、0.80、0.63、0.37、0.60、0.68、0.57和0.37;以DNA测序为为参照,八种药物耐药性检出率分别为97.9%(189/193)、97.7%(171/175)、97.8%(134/137)、82.0%(91/111)和93.7%(59/63)、92.9%(13/14)、90.0%(9/10)、90.0%(9/10);特异度分别为99.2%(132/133)、97.4%(148/152)、100.0%(189/189)、99.1%(213/215)和100.0%(107/107)、99.4%(155/156)、99.4%(159/160)、99.4%(159/160);Kappa值分别为0.97、0.96、0.98、0.84、0.95、0.92、0.89和0.89。本研究建立的反向斑点杂交技术对结核分枝杆菌八种药物的耐药性具有良好检测效果,为开发快速检测耐药性试剂盒奠定基础,在结核病一、二线八种抗结核药物耐药性检测和监测上具有良好的应用前景。
【关键词】：结核分枝杆菌 反向斑点杂交技术 耐药性 耐药相关基因
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 缩略词12-14
• 第1章 绪论14-18
• 第2章 材料与方法18-34
• 2.1 实验材料18-21
• 2.2 实验方法21-34
• 第3章 结果34-66
• 3.1 反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌耐药性条件的建立与优化34-40
• 3.2 一线抗结核药物耐药性试验检测结果40-55
• 3.3 二线抗结核药物耐药性试验检测结果55-66
• 第4章 讨论66-76
• 4.1 目前MTB药物敏感性试验方法比较分析66
• 4.2 反向斑点杂交技术检测MTB耐药性条件优化66-67
• 4.3 反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌一线药物耐药性67-71
• 4.4 反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌二线药物耐药性71-76
• 第5章 结论76-78
• 参考文献78-84
• 文献综述84-96
• 参考文献92-96
• 作者攻读学位期间的科研成果96-97
• 资助本论文的科研项目97-98
• 致谢98

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 李勇军 ,李少侠 ,张玉振 ,丁娟 ,王娜;骨伤感染中耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌耐药性检测[J];中医正骨;2002年05期

2 朱光明;从宏亮;;临床分离的洋葱伯克霍尔德菌的耐药性分析[J];现代中西医结合杂志;2010年13期

3 王洪波,桂清荣,申正义,刘波波;儿科感染致病菌814株耐药性检测[J];新医学;2000年04期

4 葛超荣,林瑞炮;结核分枝杆菌耐药机制及耐药性检测的研究进展[J];中华检验医学杂志;2001年02期

5 金法祥 ,李水法;绍兴市甲型副伤寒沙门菌耐药性检测[J];医学文选;2001年05期

6 温晓峥,李智潮;176株福氏2a型志贺氏菌耐药性检测[J];四川省卫生管理干部学院学报;2002年01期

7 杨坤,李敬云;人类免疫缺陷病毒1型耐药性检测方法及其应用进展[J];中华检验医学杂志;2005年07期

8 应英;海岛渔民甲型副伤寒沙门菌耐药性监测[J];江西医学检验;2005年02期

9 狄云湘;应英;;某海岛甲型副伤寒沙门菌耐药性监测[J];上海预防医学杂志;2006年10期

10 朱燕飞;;女性生殖道支原体感染及耐药性分析[J];浙江预防医学;2008年10期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 尚旭明;王海燕;;耐甲氧西林葡萄球菌的耐药性分析[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年

2 李羲;;肺癌耐药性检测与克服耐药性策略[A];中华医学会第五届全国胸部肿瘤及内窥镜学术会议论文汇编[C];2011年

3 张健源;李传友;程君;;应用改良的耐药性检测法观察结核分枝杆菌耐药的动态变化[A];中华医学会结核病学分会2010年学术年会论文汇编[C];2010年

4 叶卫红;刘翠银;;268例革兰阴性杆菌肺炎的病原菌分布及耐药性监测[A];湖北省暨武汉市微生物学会分析微生物专业委员会第十届第五次学术会议论文汇编[C];2008年

5 王春光;张铁;韩伟;翟向和;李清艳;吕建存;;禽致病性大肠埃希菌的分离鉴定与耐药性监测[A];京津冀畜牧兽医科技创新交流会暨新思想、新观点、新方法论坛论文集[C];2008年

6 管婧;卓超;苏丹虹;李红玉;;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性及基因分型分析[A];第8届全国抗菌药物临床药理学术会议暨北京大学临床药理研究所成立三十周年论文集[C];2010年

7 杨华;胡忠义;;变性高效液相色谱在结核分枝杆菌耐药性检测中的应用研究[A];2006中国防痨协会全国学会会议论文集[C];2006年

8 肖二辉;石娜;陈永平;;2003-2008年我院细菌耐药性变化的分析[A];2009香港-北京-杭州内科论坛暨2009年浙江省内科学学术年会论文汇编[C];2009年

9 郭瑞林;苏冰;王小华;任忠良;张晓雪;;咸阳地区医院细菌感染发生率与耐药性监测研究[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年

10 谷海瀛;;Helicobacter pylori分离培养鉴定分型及耐药性检测研究[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年

中国重要报纸全文数据库 前4条

1 北京市结核病胸部肿瘤研究所 韩喜琴;RFP和RBT耐药性与rpoB突变有关[N];中国医药报;2011年

2 ;中国建立基因型分析方法[N];中国高新技术产业导报;2002年

3 赵喜明;耐药细菌叫板声急[N];中国医药报;2004年

4 于海源;细菌对消毒剂也产生耐药性[N];中国医药报;2000年

中国博士学位论文全文数据库 前5条

1 孙慧涌;自由能计算方法在耐药性机制分析和遗传病治疗中的应用[D];苏州大学;2015年

2 苏齐鉴;广西HIV-1耐药性及关联因素研究与主要流行株亚型快速鉴定方法的建立[D];广西医科大学;2009年

3 贾峥;HIV-1表型耐药以及基因型耐药的检测与分析[D];北京协和医学院;2010年

4 王秀英;葡萄提取物消除大肠杆菌耐药性的研究[D];四川大学;2006年

5 张强;副猪嗜血杆菌喹诺酮耐药分子特征及猪链球菌多重耐药机制研究[D];华中农业大学;2015年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 方爽;延边部分地区犬源腹泻致病菌的分离鉴定及耐药性分析[D];延边大学;2015年

2 张金宝;宁夏地区牛源大肠杆菌优势血清型和毒力基因检测及耐药性分析[D];宁夏大学;2015年

3 钱海英;聊城地区临床分离主要病原菌的分布特征及耐药性[D];山东大学;2015年

4 曹蕴;130例表皮葡萄球菌临床分离株的耐药性分析和mecA/icaA/icaD基因研究[D];安徽医科大学;2014年

5 王颖;白城地区动物源链球菌耐药性检测及优化临床用药方案的研究[D];吉林农业大学;2015年

6 卢婷;牛源大肠杆菌耐药性和耐药基因检测及对喹诺酮类药物防突变浓度的测定[D];东北农业大学;2015年

7 张晓丹;猪舍环境大肠杆菌耐药性及其向周边环境传播的研究[D];山东农业大学;2015年

8 杜文燕;重症监护病房呼吸机相关性肺炎与非呼吸机相关性肺炎病原菌及耐药性的分析比较[D];青岛大学;2015年

9 郭倩;反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌八种药物耐药性的研究[D];南华大学;2015年

10 张爱民;不同来源乳酸菌的耐药性分析及药敏性乳酸菌的应用[D];扬州大学;2008年

  本文关键词：反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌八种药物耐药性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：296385