抗胰岛素单克隆抗体和多克隆抗体的制备
本文关键词：抗胰岛素单克隆抗体和多克隆抗体的制备，，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：胰岛素是生物体内非常重要的降糖激素,它是糖尿病诊断、糖尿病相关研究及糖尿病治疗药物研发等过程中重要的检测指标和研究靶点。因此,检测胰岛素水平是必需的技术要求。目前,用于检测胰岛素含量的方法大都基于抗原抗体特异性反应的原理,因此制备高效、特异的抗胰岛素单克隆抗体和多克隆抗体是建立胰岛素检测方法的重要基础。在本研究中,我们制备了抗胰岛素单克隆抗体和多克隆抗体,并对抗体的特性进行初步研究,得到以下结果。1.检测抗胰岛素抗体水平的间接ELISA方法条件的优化。在进行阳性克隆筛选前我们要对测定抗体水平的间接ELISA方法的条件进行优化。本研究中我们分别从抗原包被浓度、小鼠血清稀释比例、封闭液种类、封闭时间、血清作用时间、酶标抗体稀释比例和孵育时间等反应条件进行了优化。优化结果如下:抗原最佳包被浓度为5μg/mL,小鼠血清最优稀释比例为1:100,最佳封闭液为1%BSA,其最优封闭时间为2 h,血清最佳作用时间为1.5 h,酶标抗体最佳稀释比例为1:6000,其最优作用时间为30 min。2.抗胰岛素单克隆抗体的制备。首先,我们用商品化的猪胰岛素作为抗原,采用背部多点注射和腹腔注射的方式免疫BALB/c小鼠,刺激小鼠产生免疫反应。三次免疫后,通过间接ELISA方法检测小鼠血清效价,优先选择效价高的小鼠进行加强免疫。然后在加强免疫后3天处死小鼠,无菌取脾,获得的脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞或者NS-1细胞通过化学试剂聚乙二醇(PEG)诱导融合。本研究中总共进行了4次细胞融合,经筛选和亚克隆,最后获得三株阳性杂交瘤细胞,分别为2D7、4D4和5D12。经Mouse单抗亚型鉴定试剂盒鉴定抗体亚型全为IgM型,轻链为Kappa。通过体内诱生的方法产生大量单克隆抗体,经测定,2D7、4D4、5D12腹水效价分别为1:3200、1:51200和1:12800。利用优球蛋白纯化法得到初纯抗体。最后,我们鉴定了抗体的特异性和交叉反应性。ELISA检测结果显示,三种单克隆抗体均与牛胰岛素发生交叉反应。Western blot实验结果提示,三种抗体可能识别胰岛素的构象性表位,而非线性表位。3.抗胰岛素多克隆抗体的制备。我们用商品化的猪胰岛素和牛胰岛素分别作为抗原,采用背部多点注射和腹腔注射的方式免疫豚鼠。一共免疫4次,最后免疫5天后,采用心脏取血的方法收集大量血清。利用间接ELISA方法测定血清效价,抗原为猪胰岛素的豚鼠血清效价为1:25600,抗原为牛胰岛素的豚鼠血清最高效价为1:51200。经饱和硫酸铵沉淀后,成功获得粗纯的多克隆抗体。随后我们鉴定了抗体的特异性和交叉反应性。ELISA检测结果显示,抗猪胰岛素多克隆抗体能与牛胰岛素发生交叉反应,且抗牛胰岛素多克隆抗体与猪胰岛素也能发生交叉反应。Western blot实验结果显示,两种多克隆抗体均能与猪胰岛素和牛胰岛素特异性结合。综上所述,我们成功地获得了3株分泌抗胰岛素单克隆抗体的杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体,同时也成功地制备出抗胰岛素多克隆抗体,并对抗体特性进行了初步研究,为实验室自行建立胰岛素水平的检测方法提供基础。
【关键词】：胰岛素 单克隆抗体 多克隆抗体 ELISA Western blot
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：
- 摘要4-6
- Abstract6-10
- 引言10-11
- 第一部分 文献综述11-20
- 一、胰岛素及其应用11-12
- （一）胰岛素的分子结构11
- （二）胰岛素的生物学功能及应用11-12
- 二、胰岛素检测手段12-15
- （一）放射免疫分析法12
- （二）免疫放射分析法12-13
- （三）酶联免疫分析法13
- （四）荧光免疫分析法13-14
- （五）化学发光免疫分析法14
- （六）其他新型的检测技术14-15
- 三、抗体的研究进展及其应用15-19
- （一）抗体制备技术15-17
- （二）抗体研究进展17-18
- （三）抗体的应用18-19
- 四、本课题研究的目的与意义19-20
- 第二部分 材料与方法20-32
- 一、实验材料20-25
- （一）实验仪器及器材20
- （二）实验动物及细胞系20
- （三）实验试剂20-21
- （四）主要溶液配制21-25
- 二、实验方法25-32
- （一）细胞培养相关实验方法25
- （二）间接ELISA25-26
- （三）抗胰岛素单克隆抗体制备26-28
- （四）抗胰岛素多克隆抗体制备28-29
- （五）SDS-PAGE电泳分离和考马斯亮蓝染色29-30
- （六）抗体特性鉴定30-32
- 第三部分 实验结果32-48
- 一、不同物种来源的胰岛素蛋白质序列对比32-33
- 二、检测抗体水平的间接ELISA方法条件的优化33-37
- （一）检测抗胰岛素单抗的间接ELISA方法最佳工作条件的确立33-36
- （二）检测抗胰岛素多抗的间接ELISA方法最佳工作条件的确立36-37
- 三、抗胰岛素单克隆抗体制备37-44
- （一）小鼠加强免疫前小鼠血清效价测定37-38
- （二）细胞融合38-39
- （三）阳性克隆检测、筛选及亚克隆39-41
- （四）单抗亚型鉴定41
- （五）单抗腹水制备及效价检测41-42
- （六）单抗纯化42-43
- （七）单抗交叉反应性分析43-44
- 四、抗胰岛素多克隆抗体制备44-48
- （一）免疫动物血清效价测定44-45
- （二）多抗纯化45
- （三）多抗纯化后效价测定45-46
- （四）多抗交叉反应性分析46-48
- 第四部分 讨论48-52
- 第五部分 结论52-53
- 参考文献53-58
- 英文缩写词58-59
- 致谢59-60
- 作者简介60
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本文关键词：抗胰岛素单克隆抗体和多克隆抗体的制备，由笔耕文化传播整理发布。
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