建立从外周血获得外源基因非整合的诱导性多潜能干细胞的方法

发布时间：2017-05-23 11:05

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【摘要】：本文描述了我们以外周血单核细胞为诱导的初始材料获得外源基因非整合的病理特异诱导多潜能干细胞(iPSCs)的过程,并成功获得5例病人的共64株外源基因非整合的iPSCs细胞株的成果。我们利用密度梯度离心的方法从外周血中分离得到外周血单核细胞(PBMNC),经过6-7天的富集培养后将携带在附加体质粒上的外源基因导入到PBMNC的细胞内,经过4周左右可诱导得到外源基因非整合的iPSCs。外周血是比较容易获得人体初始细胞的来源,而且外周血单核细胞(PBMNC)群体内含有的造血祖细胞和造血干细胞是可以作为很好的诱导iPSCs的初始细胞,然而在自然状态下的这些细胞的比例很低,经过6-7天的富集培养后可以有效地提高它们的比例,并提高iPSCs的诱导效率。本研究采用的血液来自于非梗阻型无精子症(NOA)患者,NOA是所有的男性不孕不育性疾病中最为严重的一类,环境因素和遗传缺陷都可以导致NOA。Y染色体AZF区缺失与NOA有较高的相关性,是最常见的一种遗传缺陷,也是研究得较为清楚的一种。AZF区缺失导致的NOA在目前仍然没有行之有效的治疗方法,而且由于部分NOA缺失基因在小鼠中不存在,无法建立类似于其它人类疾病的小鼠模型。利用多潜能干细胞体外分化模拟特定的发育过程已经被证明是一种可行的建立体外模型的方法。我们的鉴定结果显示我们获得的细胞株在所有已鉴定的特征上均与人胚胎干细胞类似,具有正常的核型而且没有载体整合,同时它们还带有病人原始的基因组缺陷。因而我们获得的NOA病理特异的外源基因非整合的iPSCs可以被用来建立一个相关疾病的体外模型,并用其来研究NOA的发病机制或者人类精子发育。
【关键词】：诱导性多潜能干细胞 非整合 外周血
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2;Q813
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 第一章12-24
• 胚胎干细胞及其应用12-13
• iPSCs的出现及其应用13-14
• 外源基因非整合的iPSCs14-17
• NOA的概况17
• NOA的发病原因17-18
• AZF区缺失引起的NOA18-20
• NOA的治疗手段的开发20-24
• 第二章24-45
• 实验所用仪器24-25
• 实验所用材料25
• 实验所用试剂25-26
• 实验所用抗体26
• 基础培养基26-27
• 培养基添加剂27
• 实验所用引物27-31
• 实验所用试剂盒31
• 实验所用常规耗材31
• 试剂配置方法31-35
• 实验方法35-45
• 一. Western blot35-36
• 二. 基因组DNA抽提36-37
• 三. 质粒提取37
• 四. 核型分析37-38
• 五. ESC及iPSCs的培养,传代,冻存与复苏38-39
• 六. 外源基因非整合iPSCs的诱导39-41
• 七. 免疫荧光41-42
• 八. EB形成与分化42
• 九. 畸胎瘤形成与切片染色42-45
• 第三章45-61
• iPSCs诱导的过程及诱导结果45-49
• iPSCs的来源鉴定49-50
• 核型鉴定与载体残余检测50-52
• iPSCs与ESC细胞的特征的相似性52-56
• 分化能力检测56-59
• 遗传缺陷的鉴定59-61
• 第四章61-66
• 总结61
• 讨论61-66
• 诱导过程及诱导效率61-62
• 较高的建系成功率62-63
• 样本来源63-64
• 非整合策略的优势64-65
• 材料选择65-66
• 参考文献66-72
• 致谢72

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本文编号：387738