Akt特异性抑制剂对小鼠植入前胚合子基因组激活的影响

发布时间：2017-09-04 06:27

  本文关键词：Akt特异性抑制剂对小鼠植入前胚合子基因组激活的影响

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【摘要】：目的:通过观察Akt特异性抑制剂API-2和MK2206对小鼠1-细胞胚体外发育的影响及Akt特异性抑制剂对体外发育2-细胞胚内Akt主要活性形式p-Ser473-Akt定位与表达的改变,结合Akt特异性抑制剂API-2对小鼠合子基因组激活(Zygotic Gene Activation,ZGA)中四个标志基因和干细胞因子Oct4与Sox2的表达影响,为进一步探讨Akt在小鼠植入前胚发育ZGA中可能发挥的作用提供基础。方法:1.收集KM小鼠体内植入前胚(1-细胞胚至4-细胞胚),应用免疫荧光技术观察细胞内p-Ser473-Akt和总Akt(pan-Akt)的表达与定位情况。2.收集KM雌性小鼠与KM雄性小鼠交配所得的1-细胞胚,分别观察其在KSOM培养液、不同浓度的API-2和MK2206的KSOM培养液中体外发育的情况;3.收集KM小鼠1-细胞胚,分别置于KSOM和含API-2(2μM)和MK2206(30μM)的KSOM培养液中培养,获取体外发育的2-细胞胚,采用免疫荧光技术观察细胞内p-Ser473-Akt和pan-Akt的定位与表达情况;4.收集KM小鼠1-细胞胚,分别置于KSOM和含API-2(2μM)的KSOM培养液中培养,获取体外发育的2-细胞胚,运用Real-Time PCR技术检测Hsp70.1、Zscan4d、Mu ERV-L和e IF-1A等ZGA标志基因m RNA的表达水平。5.收集KM小鼠1细胞胚,分别置于KSOM和含API-2(2μM)的KSOM培养液中培养,获取体外发育的2-细胞胚,运用Real-Time PCR技术检测干细胞因子Oct4和Sox2的m RNA表达水平。结果:1.p-Ser473-Akt和pan-Akt存在于小鼠植入前胚的1-细胞至4-细胞阶段。作为Akt主要的活性形式,p-Ser473-Akt在小鼠1-细胞胚至4-细胞胚内定位存在动态变化,其在1-细胞胚和2-细胞胚期间核内出现的时间与ZGA发生的时相(minor ZGA和major ZGA)基本一致。pan-Akt主要分布在胞质里,在不同发育阶段的细胞中其表达和定位没有发生明显的改变;2.Akt特异性抑制剂API-2和MK2206对小鼠1-细胞胚的体外发育具有明显的抑制作用,呈剂量依赖性。一定浓度的API-2(2.0μM)和MK2206(30μM)均可使体外培养的1-细胞胚出现“2-细胞阻滞”现象;3.2.0μM API-2和30μM MK2206阻滞的2-细胞胚内,p-Ser473-Akt在细胞核内的表达发生了明显的下调,而pan-Akt的定位与表达并没有产生明显的变化;4.2.0μM API-2诱导阻滞的2-细胞胚内,Mu ERV-L和e IF-1A的m RNA水平明显低于KSOM对照组(P0.05),而其他基因的m RNA水平与KSOM组比较,没有明显差别(P0.05)。5.2.0μM API-2诱导阻滞的2-细胞胚内,干细胞因子Oct4的m RNA水平明显低于KSOM对照组(P0.05),而Sox2的m RNA水平与KSOM组比较,没有明显差别(P0.05)。结论:Akt主要活性形式p-Ser473-Akt在小鼠1-细胞胚至4-细胞胚内定位存在动态变化,其在1-细胞胚和2-细胞胚期间核内出现的时间与ZGA发生的时相(minor ZGA和major ZGA)基本一致,提示p-Ser473-Akt可能参与ZGA过程。Akt特异性抑制剂API-2和MK2206对小鼠1-细胞胚的体外发育具有明显的抑制作用,一定浓度的API-2(2.0μM)和MK2206(30μM)均可使体外培养的1-细胞胚出现“2-细胞阻滞”现象,同时,也使2-细胞胚核内p-Ser473-Akt表达水平下降。且一定浓度的API-2(2.0μM)使2-细胞胚内ZGA标志基因Mu ERV-L和e IF-1A,以及干细胞因子Oct4的m RNA水平明显下调。这些结果进一步证实,Akt特异性抑制剂诱导产生的“2-细胞阻滞”,以及ZGA启动失败和干细胞因子Oct4表达下调与其降低核内p-Ser473-Akt表达水平有关。
【关键词】：p-Ser473-Akt 小鼠植入前胚 2-细胞阻滞 合子基因组激活
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R321
【目录】：

• 英文缩略词表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-13
• 材料和方法13-23
• 1. 材料13-18
• 1.1 实验动物13
• 1.2 主要实验仪器、试剂和耗材13-15
• 1.3 Akt特异性抑制剂配制15
• 1.4 免疫荧光染色相关试剂配制15-16
• 1.5 引物设计、合成、保存与配制16-17
• 1.6 RT-PCR相关试剂配制17-18
• 2. 方法18-23
• 2.1 小鼠植入前胚（1-细胞胚至 4-细胞胚）的收集18
• 2.2 小鼠 1-细胞胚的体外培养18-19
• 2.3 免疫荧光实验操作步骤19-20
• 2.4.Real-Time实验操作步骤20-23
• 2.5.统计学处理23
• 结果23-33
• 1. 免疫荧光染色和细胞培养结果23-29
• 1.1 p-Ser473-Akt和pan-Akt在小鼠 1-细胞胚 至 4-细胞胚阶段的分布23-24
• 1.2 Akt特异性抑制剂API2和MK2206对体外小鼠植入前胚发育的影响24-29
• 1.2.1 API-2 对小鼠 1-细胞胚体外发育的影响24-27
• 1.2.2 MK2206对小鼠 1-细胞胚体外发育的影响27-29
• 1.3 API-2 和MK2206对体外发育 2-细胞胚内p-Ser473-Akt和pan-Akt定位与表达的影响29
• 2. Real-Time PCR结果29-33
• 2.1 内参基因H2afz，四个ZGA标志基因和干细胞因子Oct4、Sox2的扩增和溶解曲线29-31
• 2.2 API-2 对体外培养小鼠 2-细胞胚内ZGA标志基因的影响31-32
• 2.3 API-2 对体外培养小鼠 2-细胞胚内干细胞因子Oct4和Sox2的m RNA表达水平的影响32-33
• 讨论33-38
• 结论38-39
• 参考文献39-44
• 综述44-53
• 参考文献49-53
• 致谢53

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 王喜宏;和协超;韩树标;季维智;郑萍;;PTEN在小鼠卵细胞和早期胚胎发育中的功能研究[J];动物学研究;2011年06期

2 邵根宝;高爱民;徐银学;丁红梅;贾超;刘红林;;小鼠植入前胚胎MuERV-L基因表达特征研究[J];南京农业大学学报;2007年04期

3 金鹰,郭小昭,李莉,谢传昀,谭丽玲;自分泌生长因子对早期胚胎体外发育的影响(简报)[J];实验生物学报;2001年01期

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本文编号：789887