动物神经干细胞增殖和分化中的自噬作用研究
发布时间：2014-08-13 17:44
第一章 文献综述细胞的研究进展
1.1 神经干细胞的研究进展
研究发现，神经干细胞分布在哺乳动物大脑的特殊区域，比如室管膜下区（The Subventricular Zone, SVZ）、海马区( Hippocampus, HP )等等，这些细胞都具有一致的生物学特性，就是不断分裂增殖、多分化潜能的特性，它们在不同的诱导条件下可以分化为神经元、星型胶质细胞和突触胶质细胞。随着神经干细胞研究的深入，研究者发现，内源性或外源性神经干细胞可能成为神经损伤及神经退行性疾病治疗的一种崭新的治疗手段。但在许多疾病状态下，由于神经干细胞生存微环境的改变，导致神经干细胞之间的信号通路发生改变，这不但影响了神经干细胞分化的可塑性，甚至还可能影响其存活性。
1.2 自噬研究进展
通常，在细胞内部错误折叠蛋白及大量冗余的蛋白质主要通过两种方式进行降解：一种是泛素-蛋白酶体系统，也就是说细胞内的蛋白通过内质网大量积聚后引起细胞内质网应激，从而激活泛素蛋白酶体途径将多余的细胞通过蛋白酶体途径消化降解；而另外一种是自噬-溶酶体介导的细胞自噬(autophagy)途径。自噬（Autophagy），广泛存在于真核细胞中，是一种基本的生命现象；最早是在1962 年由学者 Ashford 和 Porter 在研究细胞功能时发现细胞存在“自己吃自己”的现象后而提出的。通常所指的细胞自噬是指细胞内部通过自噬途径降解细胞内的多余的或者错误折叠的蛋白以及功能受损伤的细胞器，从而清除细胞内的垃圾并维持细胞内环境的稳定，达到细胞稳定的过程[43]。
目前，研究者主要利用几种自噬标志性蛋白作为判断自噬发生活化的标志。LC3及p62蛋白在细胞质内发生点状积聚说明自噬的发生，是判断自噬活化公认的金标准。蛋白酶体降解和自噬是处理蛋白的两个主要机制。与蛋白酶体不同的是，自噬能降解可溶和聚集的蛋白。因此，在自噬过程中，胞浆蛋白-包括细胞器和其他成分-由双层膜包裹形成自噬体。这些囊泡的成熟包括他们与溶酶体的融合，导致自噬体内容物被溶酶体酶降解。一系列的应激信号，如营养剥夺或用不同抗癌剂（包括诱导ER应激）刺激自噬过程发生-这被认为是细胞必要的反应，参与细胞内一些生理功能。
自噬在细胞内的发生速率是很低的，因此只有在特定的条件下才被激活。暴露细胞于自噬触发刺激下，启动一系列自噬结构的形成使IM出现并延伸。哺乳动物细胞内IM确切的来源还不清楚，尽管已被证实可能是新合成的脂类或由ER、Golgi或内体芽生的小泡。跨膜蛋白Atg8和VMP-1对于自噬体的形成是必须的，他们在转运脂类到IM发挥重要作用，同时募集其它蛋白参与自噬的启动。因此，Atg8从顺式高尔基转位到自噬起始点似乎是自噬起始阶段的关键事件。
……………………
第二章 实验部分...................................23
2.1 大鼠神经干细胞的分离与培...........23
2.1.1 前言..............................23
2.1.2 材料和方法 ......................................24
2.1.3 实验结果 ........................34
2.1.4 讨论......................................40
2.1.5 小结....................................42
2.2 自噬对大鼠神经干细胞增...........................42
2.2.1 前言................................................42
2.2.2 材料和方法 ..........................................44
2.2.3 实验结果 .........................................50
2.2.4 讨论............................60
2.2.5 小结..........................................62
第三章 结 论....................................63
……………………
第二章 实验部分
2.1 大鼠神经干细胞的分离与培养
神经干细胞（Neural Stem Cells, NSCs）的研究已成为热点，其研究为治疗一些神经退行性疾病和神经系统损伤性疾病带来了希望，为中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）的重建和神经再生提供了一条新的途径。神经干细胞研究之所以能成为研究热点之一，源于其重要的发育机制和潜在的临床应用价值。
虽然神经干细胞的来源有所不同，但是目前关于神经干细胞的分离、培养的技术已经相对成熟，不同实验室虽然培养方法略有不同，但是整体上没有太大分别。目前，一般的实验室利用悬浮培养法在无血清的培养基中分离培养神经干细胞，由于非神经干细胞在这种缺少血清的培养系统中缺乏营养而无法存活，最终只有能够适应无血清培养基的神经干细胞能够存活，并且在生长因子的作用下，这些神经干细胞可以进行生长增殖。在这种条件下培养，神经干细胞逐渐形成聚集生长在一起的神经球，经过标志性蛋白染色及 Western Blot 结果显示，神经球中的多数细胞具备神经干细胞特征。利用胰酶消化、破碎，将成团生长的神经球打碎，就可以获得分散的神经干细胞。目前，实验室中培养神经干细胞一般采用的培养基是无血清的 N2B27，同时在培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(mEGF)。
2.2 自噬对大鼠神经干细胞增殖和分化中的影响
自噬（Autophagy），是一种基本的生命现象；自噬最早是在 1962 年由学者 Ashford 和 Porter 在研究细胞功能时发现细胞存在“自己吃自己”的现象后而提出的。通常所指的细胞自噬是指细胞内部通过自噬途径降解细胞内的多余的或者错误折叠的蛋白以及功能受损伤的细胞器，从而清除细胞内的垃圾，维持细胞内环境的稳定，达到细胞稳定的过程[82]。自噬就是指细胞通过某种方式消化降解自身细胞中的部分蛋白或者细胞器，以适应恶劣的环境。研究发现，在饥饿条件下，自噬可以消化降解细胞内多余的或者错误折叠的蛋白以及功能受损伤的细胞器，而降解产物再被细胞重新利用，达到维持细胞内环境稳定的作用。自噬在细胞发育、组织重塑、细胞免疫、适应环境等方面发挥着十分重要的作用。
自噬程序活化的最终结果，主要依赖于细胞成分和应激信号诱导的强度和持续时间。因此，除了其在细胞稳态上的作用外，自噬可以是一种细胞程序性死亡方式或发挥细胞保护作用，例如在营养缺乏条件下。并且，自噬在癌症中发挥双重作用。一方面，在肿瘤发生的早期起始阶段，这一细胞过程可以帮助细胞克服由缺氧和缺营养引起的应激；另一方面，自噬可以发挥肿瘤抑制作用，通过提供最少的 ATP 用于 DNA 修复，避免氧化应激和肿瘤内坏死及局部炎症。并且，不同抗癌治疗激活了肿瘤细胞的自噬，这既可以促进肿瘤细胞死亡，或者成为化疗耐受的机制。在神经系统中，自噬具有重要的生理功能：如应对代谢应激，如生长因子损耗，营养匮乏等；作为细胞管家清除有缺陷蛋白或细胞器，阻止异常蛋白聚集体沉淀；而且越来越多的证据表明，自噬在神经损伤及神经退行性疾病中均扮演着重要的角色[45, 46]。而内源性或外源性神经干细胞在这种环境中是否也发生自噬，自噬是否影响神经干细胞的增殖与分化目前还没有确切的报道。
……………………
第三章 结 论
本研究利用胎鼠大脑皮质细胞悬浮培养成功获得大鼠神经干细胞，在 EGF、bFGF 缺失的情况下，神经球的生长缓慢，但仍具备神经干细胞的特性，与对照组相比，神经干细胞突起明显增长，提示神经干细胞向神经细胞分化。进一步的观察发现，在神经干细胞培养体系中短期撤除 EGF/bFGF 会激活自噬起始基因Beclin1 的表达，同时促进促凋亡相关蛋白 Bax 的表达，抑制抑凋亡蛋白 Bcl-2的表达，促进细胞凋亡发生，影响神经干细胞的增殖和分化，而抑凋亡蛋白 Bcl-2的表达降低，进一步激活了 Beclin1 的活化，诱导自噬的发生，而自噬又影响了干细胞的增殖和分化。本研究表明细胞自噬可能参与大鼠神经干细胞的增殖与分化，为进一步研究中枢神经系统疾病的发病机制和治疗手段提供新的线索。
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参考文献（略）
本文编号：8310
1.1 神经干细胞的研究进展
研究发现，神经干细胞分布在哺乳动物大脑的特殊区域，比如室管膜下区（The Subventricular Zone, SVZ）、海马区( Hippocampus, HP )等等，这些细胞都具有一致的生物学特性，就是不断分裂增殖、多分化潜能的特性，它们在不同的诱导条件下可以分化为神经元、星型胶质细胞和突触胶质细胞。随着神经干细胞研究的深入，研究者发现，内源性或外源性神经干细胞可能成为神经损伤及神经退行性疾病治疗的一种崭新的治疗手段。但在许多疾病状态下，由于神经干细胞生存微环境的改变，导致神经干细胞之间的信号通路发生改变，这不但影响了神经干细胞分化的可塑性，甚至还可能影响其存活性。
1.2 自噬研究进展
通常，在细胞内部错误折叠蛋白及大量冗余的蛋白质主要通过两种方式进行降解：一种是泛素-蛋白酶体系统，也就是说细胞内的蛋白通过内质网大量积聚后引起细胞内质网应激，从而激活泛素蛋白酶体途径将多余的细胞通过蛋白酶体途径消化降解；而另外一种是自噬-溶酶体介导的细胞自噬(autophagy)途径。自噬（Autophagy），广泛存在于真核细胞中，是一种基本的生命现象；最早是在1962 年由学者 Ashford 和 Porter 在研究细胞功能时发现细胞存在“自己吃自己”的现象后而提出的。通常所指的细胞自噬是指细胞内部通过自噬途径降解细胞内的多余的或者错误折叠的蛋白以及功能受损伤的细胞器，从而清除细胞内的垃圾并维持细胞内环境的稳定，达到细胞稳定的过程[43]。
目前，研究者主要利用几种自噬标志性蛋白作为判断自噬发生活化的标志。LC3及p62蛋白在细胞质内发生点状积聚说明自噬的发生，是判断自噬活化公认的金标准。蛋白酶体降解和自噬是处理蛋白的两个主要机制。与蛋白酶体不同的是，自噬能降解可溶和聚集的蛋白。因此，在自噬过程中，胞浆蛋白-包括细胞器和其他成分-由双层膜包裹形成自噬体。这些囊泡的成熟包括他们与溶酶体的融合，导致自噬体内容物被溶酶体酶降解。一系列的应激信号，如营养剥夺或用不同抗癌剂（包括诱导ER应激）刺激自噬过程发生-这被认为是细胞必要的反应，参与细胞内一些生理功能。
自噬在细胞内的发生速率是很低的，因此只有在特定的条件下才被激活。暴露细胞于自噬触发刺激下，启动一系列自噬结构的形成使IM出现并延伸。哺乳动物细胞内IM确切的来源还不清楚，尽管已被证实可能是新合成的脂类或由ER、Golgi或内体芽生的小泡。跨膜蛋白Atg8和VMP-1对于自噬体的形成是必须的，他们在转运脂类到IM发挥重要作用，同时募集其它蛋白参与自噬的启动。因此，Atg8从顺式高尔基转位到自噬起始点似乎是自噬起始阶段的关键事件。
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第二章 实验部分...................................23
2.1 大鼠神经干细胞的分离与培...........23
2.1.1 前言..............................23
2.1.2 材料和方法 ......................................24
2.1.3 实验结果 ........................34
2.1.4 讨论......................................40
2.1.5 小结....................................42
2.2 自噬对大鼠神经干细胞增...........................42
2.2.1 前言................................................42
2.2.2 材料和方法 ..........................................44
2.2.3 实验结果 .........................................50
2.2.4 讨论............................60
2.2.5 小结..........................................62
第三章 结 论....................................63
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第二章 实验部分
2.1 大鼠神经干细胞的分离与培养
神经干细胞（Neural Stem Cells, NSCs）的研究已成为热点，其研究为治疗一些神经退行性疾病和神经系统损伤性疾病带来了希望，为中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）的重建和神经再生提供了一条新的途径。神经干细胞研究之所以能成为研究热点之一，源于其重要的发育机制和潜在的临床应用价值。
虽然神经干细胞的来源有所不同，但是目前关于神经干细胞的分离、培养的技术已经相对成熟，不同实验室虽然培养方法略有不同，但是整体上没有太大分别。目前，一般的实验室利用悬浮培养法在无血清的培养基中分离培养神经干细胞，由于非神经干细胞在这种缺少血清的培养系统中缺乏营养而无法存活，最终只有能够适应无血清培养基的神经干细胞能够存活，并且在生长因子的作用下，这些神经干细胞可以进行生长增殖。在这种条件下培养，神经干细胞逐渐形成聚集生长在一起的神经球，经过标志性蛋白染色及 Western Blot 结果显示，神经球中的多数细胞具备神经干细胞特征。利用胰酶消化、破碎，将成团生长的神经球打碎，就可以获得分散的神经干细胞。目前，实验室中培养神经干细胞一般采用的培养基是无血清的 N2B27，同时在培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(mEGF)。
2.2 自噬对大鼠神经干细胞增殖和分化中的影响
自噬（Autophagy），是一种基本的生命现象；自噬最早是在 1962 年由学者 Ashford 和 Porter 在研究细胞功能时发现细胞存在“自己吃自己”的现象后而提出的。通常所指的细胞自噬是指细胞内部通过自噬途径降解细胞内的多余的或者错误折叠的蛋白以及功能受损伤的细胞器，从而清除细胞内的垃圾，维持细胞内环境的稳定，达到细胞稳定的过程[82]。自噬就是指细胞通过某种方式消化降解自身细胞中的部分蛋白或者细胞器，以适应恶劣的环境。研究发现，在饥饿条件下，自噬可以消化降解细胞内多余的或者错误折叠的蛋白以及功能受损伤的细胞器，而降解产物再被细胞重新利用，达到维持细胞内环境稳定的作用。自噬在细胞发育、组织重塑、细胞免疫、适应环境等方面发挥着十分重要的作用。
自噬程序活化的最终结果，主要依赖于细胞成分和应激信号诱导的强度和持续时间。因此，除了其在细胞稳态上的作用外，自噬可以是一种细胞程序性死亡方式或发挥细胞保护作用，例如在营养缺乏条件下。并且，自噬在癌症中发挥双重作用。一方面，在肿瘤发生的早期起始阶段，这一细胞过程可以帮助细胞克服由缺氧和缺营养引起的应激；另一方面，自噬可以发挥肿瘤抑制作用，通过提供最少的 ATP 用于 DNA 修复，避免氧化应激和肿瘤内坏死及局部炎症。并且，不同抗癌治疗激活了肿瘤细胞的自噬，这既可以促进肿瘤细胞死亡，或者成为化疗耐受的机制。在神经系统中，自噬具有重要的生理功能：如应对代谢应激，如生长因子损耗，营养匮乏等；作为细胞管家清除有缺陷蛋白或细胞器，阻止异常蛋白聚集体沉淀；而且越来越多的证据表明，自噬在神经损伤及神经退行性疾病中均扮演着重要的角色[45, 46]。而内源性或外源性神经干细胞在这种环境中是否也发生自噬，自噬是否影响神经干细胞的增殖与分化目前还没有确切的报道。
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第三章 结 论
本研究利用胎鼠大脑皮质细胞悬浮培养成功获得大鼠神经干细胞，在 EGF、bFGF 缺失的情况下，神经球的生长缓慢，但仍具备神经干细胞的特性，与对照组相比，神经干细胞突起明显增长，提示神经干细胞向神经细胞分化。进一步的观察发现，在神经干细胞培养体系中短期撤除 EGF/bFGF 会激活自噬起始基因Beclin1 的表达，同时促进促凋亡相关蛋白 Bax 的表达，抑制抑凋亡蛋白 Bcl-2的表达，促进细胞凋亡发生，影响神经干细胞的增殖和分化，而抑凋亡蛋白 Bcl-2的表达降低，进一步激活了 Beclin1 的活化，诱导自噬的发生，而自噬又影响了干细胞的增殖和分化。本研究表明细胞自噬可能参与大鼠神经干细胞的增殖与分化，为进一步研究中枢神经系统疾病的发病机制和治疗手段提供新的线索。
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参考文献（略）
本文编号：8310
本文链接：https://www.wllwen.com/xiyixuelunwen/8310.html
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