勒福特王水消解法检验硅藻的法医学应用研究

发布时间：2015-01-13 14:55

 

【摘要】 研究背景：水中尸体是法医学尸体检验中常见的类型。我国水网密集,水中尸体检验检验量很大,每年仅在广州地区发现的水中尸体就近千具。在水中发现的尸体绝大多数属于意外溺水死亡,但也可能为自杀或他杀,也不排除死后抛尸入水伪造意外溺水身亡。判断溺死或是死后入水是案件定性的关键。溺死的机制是大脑不可逆的缺氧,由于大量溺液被吸入到呼吸道及肺泡,阻碍气体交换,导致低氧血症和二氧化碳潴留,发生窒息死亡。对于新鲜的水中尸体,可以通过案情及口鼻部蕈样泡沫、水性肺气肿、呼吸道内泥沙等溺死的典型征象进行溺死鉴定。珠江水域地处亚热带气候,天气炎热,根据统计,87%的水中尸体在发现的时候已经高度腐败,对于水中高度腐败尸体的死因诊断,由于各种溺死征象已不复存在而成为世界公认的法医学难题之一。硅藻是一种单细胞藻类,全世界约有16000多种,体长一般在1μm至200μm之间,其最明显的特征是细胞壁除个别种类外,均高度硅质化,形成上、下两个透明的壳,以壳环带套合形成一个硅质细胞壁。硅藻的生活环境非常广泛,地球上凡是有水滞留的地方,几乎都能见到硅藻的踪迹。硅藻细胞壁因为抵抗力强而不易被破坏,硅质含量高者,即使用浓硫酸、浓硝酸煮沸甚至高温烧灼也难以破坏。尸体腐败时对检材组织进行消化处理也能保持其原形,这一特征非常有利于溺死诊断。自Revenstorf在1904年从肺切面液体中直接观察到硅藻后,国内外法医学工作者对硅藻检验进行了广泛的研究,在尸体内脏组织(肝、肾、骨髓)中检出硅藻被认为是明确溺死最有力的指标。通过硅藻检验对硅藻进行定性定量分析,不仅可以直接判断死因,而且对尸体和溺死可疑地点的水样种类及数量比对分析,还有助于推断溺死地点。目前法医学硅藻检验的方法很多,其主要包括样本提取及消解方法、硅藻富集方法、硅藻观察方法三个基本步骤,近百年来,硅藻检验诊断溺死研究,集中在这三个环节,其中样本提取及消解是法医学硅藻检验成功与否的首要环节和重要步骤。样本提取及消解方法1937年,Kasparek首先采用浓硝酸消解肺组织,奠定了强酸消解法的基础。在以后的法医学实践中,又发展了硝酸沙浴法、硝酸硫酸法、硝酸硫酸加过氧化氢法、硫酸加硫酸铜法和硝酸乙醇法等。但强酸消解法消解组织过程中存在工作强度高；消解时间长；反应过程剧烈,存在硝酸喷出灼伤人体的危险,所释放的二氧化氮污染环境；部分硅藻在消解过程中被破坏等缺点。Hiroshi等采用Soluene-350(助溶剂)消化组织,该法较强酸消解法节省时间,工作简单,但消化能力差,试剂来源也困难,基本不适合在法医实践中的应用。此外,还有酶消解法、微波消解法及硅胶梯度法等,但这些方法均存在消解时间长、消化能力差、消解组织量少等缺点。硅藻的富集方法离心是目前全世界法医学实验室普遍采用的硅藻富集方法。我国的人体组织器官硅藻硝酸破机法检验标准中采用4000r/min离心15min,用吸管吸去上清液,再加重蒸水平衡后离心,重复上述步骤直至上清液酸碱度在6.5-7.5间。本项目课题组赵建等研究发现4000r/min离心15min一次硅藻损失在29.94%至49.60%之间,大量的硅藻存在于被弃去的上清液中。硅藻的观察方法目前国内外法医学实验室绝大多数采用光学显微镜检测脏器组织内的硅藻,一些微型硅藻容易被漏检或受放大倍数限制无法根据硅藻表面纹饰鉴别其种属。另外,有学者认为,文献中不同研究人员报道的硅藻检验数据相差较大,可能因为所采用的光学显微镜放大倍数不同。因此光学显微镜检测法的准确性,尤其是分类的准确性有待进一步考证。Torre等和Pachar等相继报道了采用传统强酸消解与扫描电镜检测的硅藻检验方法,与光学显微镜相比,扫描电镜具有放大倍数高及景深大的优势,可观察硅藻的细微结构,而且容易实现图像存储,便于硅藻学家根据硅藻图像准确鉴定种属。由于现有硅藻检验方法的种种限制,造成硅藻检验在法医学水中尸体死因鉴定中不能完全发挥其应有的作用。而且由于硅藻检验缺乏统一规范的标准,争议较多,检材常涉及腐败组织,检验难度大,阳性率低,其次样品处理过程复杂,容易污染,操作环境恶劣,对操作者健康有害,法医学工作者一直在探讨快速、有效、准确,易于推广的新方法、新技术的研究。目的：1、建立准确、高效的硅藻检验技术；2、建立广东省珠江水域的硅藻扫描电镜图谱库,为广东法医工作者进行硅藻种类识别和落水地点推断提供科学的比对参考依据。1.季节影响.种类方法：(一)勒福特王水消解法的建立1、22只新西兰大白兔随机分为动物随机分为勒福特王水消解组10只,传统强酸消解组10只,空白对照组2只。取干净的剪刀剪取约2g肾组织,放入1OOml烧杯中剪碎。2、加入15ml浓硝酸和5ml浓盐酸；2ml过氧化氢以1滴/3秒的速度逐渐滴入烧杯中；然后静置15Mmin；3、将样本放入85℃水浴锅中加热50min(加热过程中同样以1滴/3秒的速度加入3ml过氧化氢溶液)；4、传统强酸消解法步骤：1)加入2ml水样；2)向烧杯中加入20m1分析纯浓硝酸和5ml过氧化氢；3)将样本放入85℃水浴锅中加热50min。5、真空抽滤,扫描电镜观察；6、比较两种方法的硅藻回收率、硅藻破坏和消解能力,并采用SPSS17.0进行统计学分析,计量资料采用两独立样本t检验分析、计数资料采用卡方检验分析,P<0.05为有统计学意义。(二)勒福特王水消解法检验动物器官硅藻1、44只新西兰大白兔随机分为生前入水组20只(勒福特王水消解-滤膜富集-扫描电镜观察法：10只；传统强酸消解-离心富集-光学显微镜观察法：10只),死后入水组20只(勒福特王水消解-滤膜富集-扫描电镜观察法：10只；传统强酸消解-离心富集-光学显微镜观察法：10只),陆地死亡组(对照组)4只。2、动物模型建立：溺死动物模型(将兔笼中沉入水下0.5m,1min后提出水面,30s后重新沉入相同水深处,重复以上步骤直至大白兔死亡,死后在水中浸泡30min)。死后入水组动物模型(采用耳缘静脉空气栓塞法,将死亡的兔子置于相同水域相同深度浸泡30min)。陆地死亡组动物模型(采用耳缘静脉空气栓塞法)。3、分别对实验组和对照组进行实验兔的肝脏、肺脏和肾脏进行检验,比较消解时间、检出率、检出数量和观察效果,并应用SPSS17.0进行统计学分析。(三)勒福特王水消解法检验水样硅藻1、对广东珠江流域19个采样点在2012年6月进行采样,其中包括肇庆市德庆县段等西江支流6个采样点,浈江乐昌县段等北江支流9个采样点以及龙川县段等东江支流4个采样点,其中部分采样点于2012年9月在同样地点也采集了水样。2、勒福特王水消解-滤膜富集-扫描电镜观察法检测水样中的硅藻,收集不同种类的硅藻,并将其适当倍数的电镜图像制作成图谱。结果：1、勒福特王水消解法消解肾组织后的物质残留重量为0.00604±0.00310g/2g,传统强酸消解法消解肾组织后的物质残留重量为0.00979±0.00204g/2g,两组数据具有统计学差异(t=-3.072,P<0.01)。2、勒福特王水消解法残留物质较少,硅藻纹理清晰,背景干净,极少发现硅藻碎片。3、硅藻回收率：空白对照样本中未发现硅藻。水样中的硅藻标准含量为711.2个/ml。勒福特王水消解法的硅藻回收率为71.1±10.3%,传统强酸消解法的硅藻回收率为66.3±9.0%。两组数据无统计学差异(t=1.106,P>0.05)。4、勒福特王水消解-滤膜富集-扫描电镜观察法分析肺脏、肝脏、肾脏组织中硅藻所用的时间均少于传统强酸消解-离心富集-光学显微镜观察法,其分析肺脏、肝脏、肾脏组织所用时间约为传统强酸消解-离心富集-光学显微镜观察法的1/4、1/3、1/3。5、勒福特王水消解-滤膜富集-扫描电镜观察法和传统强酸消解-离心富集-光学显微镜观察法消解肺脏、肝脏、肾脏所用时间为：肺脏<肝脏<肾脏,肺脏组织最容易消解,肝脏组织次之,肾脏组织最难消解。6、陆地死亡组中肺脏、肝脏、肾脏组织均未检出硅藻。生前入水组中,10例样本中,勒福特王水消解-滤膜富集-扫描电镜观察法均检出硅藻；传统强酸消解-离心富集-光学显微镜观察法10例肺脏组织均检出,3例肝脏组织、2例肾脏组织未检出硅藻。两组数据经卡方检验,肝脏组织两种消解方法检出率χ2=3.529,肾脏组织两种消解方法检出率χ2=2.22,两例χ2均小于χ20.05,11=3.84,P>0.05,不能认为两种方法对肝脏(或肺脏)的检出率有差异。死后入水组中,勒福特王水消解-滤膜富集-扫描电镜观察法在3例肺脏组织中检出硅藻,传统强酸消解-离心富集-光学显微镜观察法在1例肺脏组织中检出硅藻；肝脏、肾脏组织均未检出。7、生前入水组用勒福特王水消解-滤膜富集-扫描电镜观察法检出肺脏、肝脏、肾脏组织中的硅藻数量均多于传统强酸消解-离心富集-光学显微镜观察法,其在肺脏、肝脏、肾脏组织中检出的硅藻数量约为传统强酸消解-离心富集-光学显微镜观察法的10倍、4倍、6倍。死后入水组10例样本中,用勒福特王水消解-滤膜富集-扫描电镜观察法有3例检出硅藻,数量分别为12个/g、15个/g、13个/g,数量均少于20；传统强酸消解-离心富集-光学显微镜观察法有1例检出硅藻,数量为2个/g。8、光学显微镜观察微型硅藻时,以人工方式逐渐移动平台对视野中的硅藻进行观察,样品分析速度慢,硅藻表面纹理不清；扫描电镜观察时,具有自动扫描功能,自动拍摄并存储每个视场图像,样品分析速度加快,而且能观察到硅藻的细微结构。9、广东省珠江水域肇庆市德庆县段、肇庆市区江滨路段、佛山市三水区段等19个采样点共检出21种硅藻(直链藻、卵形藻、小环藻、菱板藻、菱形藻、双菱藻、针杆藻、冠盘藻、舟形藻、曲壳藻、圆筛藻、短缝藻、桥弯藻、海链藻、布纹藻、波缘藻、等片藻、辐节藻、双壁藻、异极藻和羽纹藻),分别属于羽纹纲和中心纲。结论：1、勒福特王水消解法在不降低硅藻回收率的前提下,可显著提高硅藻检验的有机质消解能力,减少消化时间,且消解后滤膜背景杂质少,硅藻表面纹理清晰,容易进行硅藻种属鉴定,具有良好的应用前景。2、建立的特定水体的硅藻扫描电镜图谱库有助于法医检验人员独立完成硅藻种属的比对,利用扫描电镜可获得脏器和水样所含硅藻的高分辨扫描电镜照片,检验人员只需进行简单的形态比较,即可判断两者中的硅藻种类是否一致。对于提高法医硅藻学水平、解决水中尸体溺死诊断难题及落水地点推断具有巨大帮助。 

前言

目前国内外法医学采用光学显微镜检测脏器组织内的硅藻。其缺点是，检测劳动强度大，微型硅藻容易被漏检或受放大倍数限制无法根据桂藻表面纹饰鉴别其种属。另外，有学者认为文献中不同研究人员报道的桂藻检验数据相差较大，可能因为所采用的光学显微镜放大倍数不同。因此光学显微镜检测法的准确性，尤其是分类的准确性有待进一步考证。由于现有硅藻检验方法的种种限制，造成硅藻检验在法医学水中尸体死因鉴定中不能完全发挥其应有的作用。而且由于桂藻检验缺乏统一规范的标准，争议较多，检材常涉及腐败组织，检验难度大，阳性率低，其次样品处理过程复杂，容易污染，操作环境恶劣，对操作者健康有害，法医学工作者一直在探讨快速、有效、准确，易于推广的新方法、新技术的研究。关键的问题是文献中描述的各种生物和细菌采用化学或基因检验方法，能否作为溺水明确的溺死证据仍然需要大量实践验证，还需要特别与传统的技术，如桂藻检测技术做一致性研究，而且部分浮游植物和浮游动物在酸消化的过程中遭到破坏，也会出现假阴性的检验结果。事实上，桂藻检验仍然被认为是水中尸体死因鉴定的黄金标准”。 各水域的桂藻构成与该水域的理化环境密切相关，不同水域的硅藻构成既有共性，又有差异。通过检验水中尸体肺、肝、肾等组织器官的娃藻，与水样中的硅藻进行对比，可以用来推断死者的落水位置，，从而为侦査提供方向。本研究除动物实验研究外，还收集了广东省珠江主要水系的水样，调查了广东省珠江水域的常见硅藻种类及数量，为广东法医工作者进行桂藻种类识别和地点推断提供了科学的比对参考依据。
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第一章勒福特王水消解法的建立

1. 材料与方法
将实验兔固定在固定器中，除去右侧耳缘静脉表面的兔毛，轻拍耳缘静脉扩张血管，注射适量空气直至兔子死亡。提取检材所用的器材必须以蒸馈水和重蒸水各冲洗两遍后用干净的塑料袋密封。盛装检材必须用干净的塑料袋或以蒸馆水和重蒸水各冲洗两遍的磨砂广口瓶。硅藻检验过程中使用的所有器械、容器在使用前均必须以超纯水各冲洗两遍。提取的检材应立即分别装入容器中密封保存、送检，不加任何防腐剂；不能立即检验的应冰冻保存。注意：上述操作必须在通风橱中进行；勒福特王水应新鲜配置，不宜储存；剩余勒福特王水应及时稀释或中和处理；不要将勒福特王水储存于封闭容器中或靠近火源。一个娃藻分裂为两个完整壳面的计为两个桂藻，桂藻碎片面积超过一半的记为一个娃藻，壳环不计数，在高倍下拍摄不同种类的桂藻高分辨扫描电镜照片，娃藻种类由珠江水利委员会娃藻研究专家进行鉴定。

 

2.结果
根据桂藻壳的形态特征和有性生殖的模式将桂藻纲分为中心目和羽纹目，其中羽纹目又分为无壳缝亚目和有壳缝亚目。广东省珠江水域肇庆市德庆县段、肇庆市区江滨路段、佛山市三水区段等19个采样点共检出21种桂藻（分类至属），笔耕文化传播，分别属于羽纹纲和中心纲，如下：植物体为单细胞，少数连成带状的群体；壳面长捕圆形、狭披针形、舟形，末端头状，纯圆形或樣状；中轴区狭，壳缝直，极节很细，中央区増厚并扩展到壳面两侧，增厚的中央区无花纹，称福节壳缝两侧具横线纹或点纹，略呈放射状的平行排列，辖节和中轴区将壳面花纹分成四个部分；具间生带，但无真的隔片，具或不具假隔片。如图3-7所示。

第二章勒福特王水消解法检验动物器官硅藻.......29
1. 材料与方法.....29
2. 结果........37
第三章勒福特王水消解法调查珠江水域硅藻种类........44
1. 材料与方法.......44
2. 结果.......25
全文小结..........82

全文小结

本研究利用勒福特王水浓硝酸：浓盐酸=3：1进行桂藻检验中有机质的消解，摸索最优实验条件，并与传统的硝酸破机法进行比较两者的消解能力、桂藻破坏和桂藻回收率，应用SPSS17.0进行统计学分析，采用检验分析结果。通过溺死动物实验，对肺、肝和肾组织中的桂藻进行检验，分别应用勒福特王水消解滤膜富集扫描电镜观察法和传统强酸消解离心富集光学显微镜观察法，对两种方法所用消化时间、检出率、检出数量以及观察方法进行比较，应用进行统计学分析，根据数据类型选取分析方法。本研究收集了广东省珠江水域19取水点的水样，采用勒福特王水进行消解，并应用扫描电镜进行分析，建立广东省珠江水域的桂藻扫描电镜图谱库，为落水地点的推断提供基础数据。首次建立勒福特王水消解法：对传统桂藻检验方法中的组织消解体系（浓确酸乙醇或乙魅）进行了改良，建立了基于勒福特王水消解体系的组织消解方法，在不降低硅藻回收率的前提下，可显著提高桂藻检验的有机质消解能力，减少消化时间，且消解后滤膜背景杂质少，桂藻表面纹理清晰，容易进行娃藻种属鉴定，具有良好的应用前景.
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展望

初步研究表明：通过建立的基于图像处理和模式识别的桂藻鉴定专家系统，可对数据库内的桂藻进行自动识别，准确率高达90%以上，甚至优于硅藻学专家的人工鉴定结果。国内高亚辉等通过光学显微镜扫描系统和提出的基于区域分割方法、阈值分割和数学形态学的处理方法对海洋桂藻自动识别进行了研究，取得了一定进展。近几年随着计算机、信息数字化技术的进步，数字化全计算机控制扫描电镜得到了很快的发展，结关技术的数字化扫描电镜具有自动获取图像、自动搜索颗粒等自动化分析功能，在环境学、材料学、矿物学等研究领域中显示了良好的应用前景。在法庭科学领域，结合自动化扫描电镜和能谱分析的射击残留物自动分析法被认为是检验射击残留物最特定的方法，在世界各国司法鉴定中得到了广泛应用。
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本文编号：11592