EBV病毒LMP1通过信号转导通路上调鼻咽癌细胞Ig kappa轻链表达的分子机制

发布时间：2017-12-28 13:07

本文关键词：EBV病毒LMP1通过信号转导通路上调鼻咽癌细胞Ig kappa轻链表达的分子机制　出处：《中南大学》2007年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 我们的前期工作从中国人鼻咽癌细胞株CNE2的基因组DNA文库中克隆了一个具有细胞恶性转化功能的基因Tx。将该基因转染小鼠上皮细胞系JB6，可使JB6细胞在软琼脂形成集落，且能使裸鼠成瘤。DNA测序及生物信息学分析发现Tx基因包含人类免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)kappa轻链基因片段C区(constant region)、J区(joining region)，但未发现V区(vauriable region)。与正常的Ig kappa基因的JC区基因片段相比较，发现Tx基因与之同源性高达99％，因此推测Tx基因是一异常的人Ig kappa轻链基因。经典免疫学理论认为正常机体中只有B淋巴细胞才能表达免疫球蛋白，其它正常的体细胞，包括上皮细胞是不表达免疫球蛋白的。然而以Tx基因为线索，我们采用免疫组化和Northern Blotting等策略发现上皮来源的肿瘤细胞包括MCF-7(人乳腺癌细胞系)、MGC(人胃癌细胞系)、SW480(结肠癌细胞系)、HeLa(人宫颈癌细胞系)、鼻咽癌细胞系及鼻咽癌组织表达Ig kappa恒定区蛋白及mRNA，并通过原位杂交发现Ig kappa表达与宫颈组织癌变的阶段性密切相关。同时，我们在正常人群和鼻咽癌病人人群中证实了Ig kappa基因上的SNP3、SNP4、SNP5和SNP6四个SNP位点，其中连锁的SNP4-SNP3基因型中的杂合型AT-GC可能是鼻咽癌患病的遗传风险因素。对Tx基因表达的初步研究表明该基因在鼻咽癌细胞株低表达，而在EB病毒阳性的B95-8及Raji细胞中Tx基因表达强烈。此外，Western印迹分析表明整合了LMP1的鼻咽癌细胞系CNE1-LMP1中Ig kappa轻链明显强于CNE1细胞的表达水平。这些现象启发我们思考LMP1在上调鼻咽癌细胞表达Ig kappa轻链中所发挥的作用，并促使我们利用鼻咽癌细胞系为实验模型，从信号传导角度对这一异常现象发生的分子机制进行较为系统地探索性研究，旨在为揭示非淋巴细胞系的其它上皮性肿瘤细胞表达免疫球蛋白分子机制提供有意义的启示和基础。 1．LMP1上调鼻咽癌细胞Ig kappa轻链表达首先，以四环素衍生物强力霉素Dox剂量诱导LMP1表达的细胞系Tet-on-LMP1 HNE2及稳定转染LMP1的鼻咽癌细胞HNE2-LMP1为基本模型，采用不同剂量Dox诱导LMP1表达后验证鼻咽癌细胞Ig kappa轻链的表达。Tet-on-LMP1-HNE2细胞用0，0.06，0.6，6.0μg／ml的Dox诱导LMP1表达后，PT-PCR分析其Ig kappa轻链保守的恒定区C区mRNA表达，发现Ig kappa轻链恒定区mRNA随LMP1诱导表达增加而增加；Western Blotting结果表明，随着Dox诱导剂量增加，LMP1表达剂量依赖性增加，同时Ig kappa轻链蛋白水平也呈相应程度地增强。Dox诱导后进行细胞内kappa轻链蛋白染色，，FACS结果表明，随着Dox剂量增加，Ig kappa轻链特异性平均荧光强度也以同样的趋势增加。然后，采用特异性靶向LMP1的脱氧核酶阻断LMP1表达的策略验证鼻咽癌细胞表达Ig kappa轻链。结果发现，特异性靶向LMP1的脱氧核酶DZ1抑制HNE2-LMP1鼻咽癌细胞LMP1表达后明显降低Ig kappa轻链蛋白水平，而对LMP1阴性鼻咽癌细胞HNE2中Ig kappa轻链含量无明显影响。通过正、反两方面实验证实鼻咽癌细胞的确表达Ig kappa轻链mRNA及蛋白，并且LMP1能够上调鼻咽癌细胞Ig kappa轻链mRNA及蛋白水平。 2．LMP1通过活化NFκB，AP-1信号通路上调鼻咽癌细胞Ig kappa轻链生物信息学预测发现异常人Ig kappa轻链基因包含了NF-κB和AP-1这两个关键的转录因子结合位点。NF-κB位点位于增强子(Enhancer)中；AP-1位点位于增强子之后的J-C内含子区，推测这两个转录因子都有可能作用于增强子，从而调节Ig kappa轻链基因表达。在验证LMP1从mRNA转录水平及蛋白质水平上调鼻咽癌细胞Ig kappa轻链的基础上，进一步研究参与此事件的信号转导通路。研究表明，Ig kappa基因Jκ-Cκ区域之间的NF-κB结合位点对B细胞Ig kappa表达十分重要，其下游AP-1结合位点对B细胞Ig kappa表达也起一定作用，而在LMP1激活的多条信号通路中，NF-kB及AP-1被认为是最重要信号通路，其活化可导致大多数LMP1下游靶基因的过表达。因此，我们提出鼻咽癌细胞异位表达Ig是否与LMP1异常活化NF-kB及AP-1信号通路相关。首先采用NF-κB抑制剂Bay11-7082、JNK抑制剂SP600125分别处理HNE2及HNE2-LMP1鼻咽癌细胞，Western Blotting分析两条通路不同层面效应分子的变化，结果显示，Bay11-7082剂量依赖性地抑制LMP1诱导的IκBα磷酸化及IκBα蛋白的降解，SP600125剂量依赖性地抑制LMP1诱导的JNK的磷酸化，对JNK的总蛋白表达无明显影响，Western Blotting及FACS结果显示两种抑制剂均剂量依赖性地降低Ig kappa蛋白表达及Ig kappa特异性平均荧光强度。我们前期工作表明IκBα显性负性突变体DNMIκBα和c-Jun显性负性突变体TAM67可以有效地抑制LMP1所诱导的NF-κB和AP-1信号传导通路活化。通过Western Blotting及FACS技术分析稳定表达DNMIκBα的鼻咽癌细胞系HNE2-LMP1-DNMIκBα及稳定表达TAM67的鼻咽癌细胞系HNE2-LMP1-TAM67中Ig kappa轻链含量，发现与亲本细胞相比，Ig kappa轻链蛋白及Ig kappa特异性平均荧光强度在两株稳定转染突变体细胞中明显降低。证实LMP1通过活化NF-κB、AP-1信号传导通路上调鼻咽癌细胞Ig kappa轻链表达。 3．LMP1通过NF-κB和AP-1信号通路上调Ig kappa轻链基因内含子增强子iEκ活性基因的表达调控需要顺式作用元件与反式作用因子共同参与。在明确转录因子NF-κB、AP-1通过NF-κB、AP-1信号传导通路参与LMP1上调鼻咽癌细胞Ig kappa轻链表达基础上，我们期望进一步明确与转录因子NF-κB、AP-1相互作用的顺式作用元件。在B细胞中，Ig kappa基因表达的必需条件之一是增强子活化。Ig kappa轻链内含子增强子内存在NF-κB结合位点，其下游为AP-1结合位点，LMP1是否通过NF-κB、AP-1信号介导活化内含子增强子而上调鼻咽癌细胞Ig kappa轻链表达? 因此，我们将包含完整iEκ(含κB位点)及AP-1位点的Ig kappa基因组DNA克隆到由SV40启动子驱动不含任何增强子元件的荧光素酶报告基因pGL3-promoter载体质粒上，通过荧光素酶强度反映iEκ增强子活性。我们首先构建了报道基因质粒pwt575。通过Luciferase报道基因分析发现转染pwt575后，LMP1阴性的HNE2细胞荧光素酶活性增加～5倍，而HNE2-LMP1细胞增加～35倍，表明iEκ增强子在表达免疫球蛋白的鼻咽癌细胞中功能性活化，在LMP1阴性鼻咽癌细胞中活性较低，在LMP1阳性鼻咽癌细胞HNE2-LMP1中活性显著增高，呈现的活性状态与Ig kappa轻链蛋白在这两株细胞中的表达水平相吻合。因此认为，增强子活化是鼻咽癌细胞表达Ig kappa轻链的重要分子机制。为进一步确定NF-κB和AP-1信号通路是否参与LMP1上调鼻咽癌细胞的iEκ活性，在野生型pwt575质粒基础上，利用基于重叠延伸PCR(overlap extension PCR)体外定点突变技术将pwt575质粒中的κB位点突变构建pmt575．κB质粒，将AP-1位点突变构建pmt575．AP-1质粒，将κB和AP-1位点同时突变构建pmt575．κB．AP-1质粒，将四种质粒分别转染HNE2和HNE2-MP1鼻咽癌细胞。结果发现，转染pwt575后，HNE2细胞荧光素酶活性增加～6倍，而HNE2-LMP1细胞荧光素酶活性增加～160倍，说明LMP1能够明显上调iE_κ活性。HNE2-LMP1细胞转染κB位点突变的pmt575．κB质粒后，荧光素酶活性增加幅度由～160倍降低到～70倍；转染AP-1位点突变的pmt575．AP-1质粒后，增加幅度由～160倍降低到～90倍；转染κB位点和AP-1位点同时突变的pmt575．κB．AP-1质粒后，增加幅度由～160倍降低到～87倍；说明Ig kappa轻链基因中κB和AP-1位点在LMP1活化鼻咽癌细胞Ig kappa内含子增强子事件中起重要作用，并且κB位点对iE_κ增强子活性的影响作用略高于AP-1位点，提示NF-κB信号通路在LMP1上调鼻咽癌细胞Ig kappa轻链表达中起主导作用。κB和AP-1位点同时突变并未进一步降低iE_κ活性，表明介导LMP1对iE_κ调控的NF-κB和AP-1两条信号通路之间不具协同效应。此外，将pwt575报道基因质粒转染HNE2和HNE2-LMP1鼻咽癌细胞后分别用20μm NF-κB抑制剂Bay11-7082、JNK抑制剂SP600125处理12小时，发现LMP1诱导的pwt575报道基因活性显著降低。将pwt575质粒转染HNE2-LMP1-DNMIκBα及HNE2-LMP1-TAM67鼻咽癌细胞，其报道基因活性在这两株稳定表达突变体细胞中显著低于其亲本细胞HNE2-LMP1。通过几方面实验证实NF-κB、AP-1信号传导通路参与了LMP1对iEκ增强子活性增强作用。在明确转录因子NF-κB和AP-1参与激活的顺式调控元件为iEκ增强子基础上，根据人Ig kappa基因iEκ的NF-κB位点序列及下游AP-1位点序列及构建突变质粒的突变序列分别合成生物素标记的野生型和突变型NF-κB、AP-1寡核苷酸探针。利用EMSA和Supershift-EMSA方法进一步分析其与Ig kappa基因相应DNA的结合能力及这两个二聚体转录因子的亚单位组成。结果表明，HNE2-LMP1细胞核蛋白与Ig kappa基因中κB DNA结合能力明显高于HNE2细胞。稳定表达IκBα显性负性突变体的鼻咽癌细胞系HNE2-LMP1-DMNIκB其核蛋白结合Ig kappa基因κB DNA能力与亲本细胞HNE2-LMP1相比明显降低。20μm Bay11-7082处理HNE2-LMP1细胞12小时后，其核蛋白与Ig kappa基因κB DNA结合能力明显降低。而生物素标记突变型NF-κB DNA探针完全不能与上述细胞核蛋白结合。Supershift结果表明直接结合到Ig kappa基因内含子增强子上的NF-κB亚单位包括p65和p52。类似地，HNE2-LMP1细胞核蛋白与Ig kappa基因中AP-1 DNA结合能力明显高与HNE2细胞。稳定表达c-Jun显性负性突变体的鼻咽癌细胞系HNE2-LMP1-TAM67其核蛋白结合Ig kappa基因AP-1 DNA的能力与亲本细胞HNE2-LMP1相比明显降低。20μm SP600125处理HNE2-LMP1细胞12小时后，其核蛋白与Ig kappa基因中AP-1 DNA结合能力明显降低。而生物素标记突变型AP-1 DNA探针完全不能与上述细胞核蛋白结合。Supershift结果表明结合到Ig kappa基因AP-1位点的转录因子包括c-Jun和c-Fos。 4．LMP1通过ERK信号通路介导，调控转录因子Ets-1磷酸化活化靶向3’Eκ从而上调Ig kappa轻链表达除内含子增强子(iEκ)外，调节Ig kappa轻链基因表达另一个重要增强子元件是位于Cκ基因片段下游的3’端增强子(3’Eκ)。生物信息学分析及相关文献报道表明，3’Eκ上存在转录因子PU．1及Ets相关蛋白一致性结合位点，基于EBV-LMP1在鼻咽癌细胞中可通过ERK介导Ets-1磷酸化活化的前期工作基础，我们推测可能存在LMP1—ERK／MAPK—Ets这样一条信号转导通路，在调控Ig kappa轻链表达中起一定作用。利用ERK特异性抑制剂PD98059阻断ERK的活性，通过IP-Western Blotting及Western Blotting检测Ets-1磷酸化水平及Ig kappa表达量变化，结果表明PD98059能剂量依赖性地抑制LMP1诱导的ERK磷酸化、抑制LMP1上调的转录因子Ets-1磷酸化及Ig kappa轻链表达。证实LMP1通过ERK信号通路介导转录因子Ets-1磷酸化活化上调Ig kappa轻链表达。为进一步确定LMP1通过ERK信号通路的介导上调转录因子Ets-1磷酸化及Ig kappa轻链表达与3’E_κ增强子相关。根据人kappa基因3’E_κ上PU位点序列及将PU核心序列突变分别合成生物素标记的野生型和突变型PU探针，通过Supershift-EMSA分析，在鼻咽癌细胞中，结合到Ig kappa基因PU位点的转录因子为Ets-1而非B细胞中的PU．1，提示鼻咽癌细胞Ig kappa基因3’端增强子活化机制与B细胞不完全相同。通过EMSA分析，我们发现LMP1表达显著增强鼻咽癌细胞中转录因子Ets-1与Ig kappa基因PU序列的结合能力。50μm PD98059完全抑制了LMP1诱导的转录因子Ets-1与Ig kappa基因PU序列的结合，生物素标记突变型PU DNA探针完全不能与上述细胞核蛋白结合形成Ets-1-DNA复合物。证实LMP1可通过活化ERK信号通路促进转录因子Ets-1与3’Eκ增强子中PU位点结合进而上调鼻咽癌细胞中Ig kappa轻链表达。利用本实验室对信号转导积累的研究优势，我们从外界致病因素EBV-LMP1对信号转导的异常调控为切入点，以鼻咽癌细胞为模型，研究上皮性肿瘤异常表达Ig的分子机制。研究发现病毒编码的瘤蛋白LMP1介导转录因子异常激活在上调鼻咽癌细胞Ig kappa表达中具有重要意义，并创新性地发现表达Ig的鼻咽癌细胞的kappa内含子增强子iEκ具有功能活性，其活性受到LMP1调控。通过实验确定了LMP1活化的三条主要信号转导通路、三个主要的转录因子及受LMP1调控的iEκ和3’Eκ这两个顺式增强子元件，证实LMP1经NF-κB、JNK／MAPK、ERK／MAPK信号通路介导，分别促进活化的转录因子NF-κB、AP-1、Ets-1与与Ig kappa基因的相应位点结合，从而上调鼻咽癌细胞Ig kappa轻链表达。此外发现LMP1通过ERK信号通路调控转录因子Ets-1靶向3’Eκ而上调鼻咽癌细胞Ig kappa轻链表达的机制与B细胞通过转录因子PU．1活化3’Eκ的机制不完全相同。通过本课题的研究，我们对鼻咽癌细胞异位表达免疫球蛋白的分子机制有了新的科学发现，所获得的原创性发现加深了我们对上皮性肿瘤细胞表达免疫球蛋白这一现象的理解。由于其它致瘤病毒编码的瘤蛋白，如：HBV的X蛋白、HPV的E6和E7蛋白，能够激活NF-κB、AP-1、ERK等信号传导通路，因此其有可能通过类似于EBV-LMP1的分子机制调控上皮性肿瘤中Ig kappa轻链表达，这对于建立致瘤病毒与上皮性肿瘤异常表达Ig之间的联系、为揭示非淋巴细胞系的其它上皮性肿瘤细胞表达免疫球蛋白分子机制提供了新的启示与思考。对经典免疫学关于免疫球蛋白表达理论将是一个重要补充。并为从一个新的角度了解肿瘤这一复杂性状疾病提供理论证据。
[Abstract]:In our previous work, a gene Tx with cell malignant transformation function was cloned from the genomic DNA Library of the Chinese nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2. The gene transfected into mouse epithelial cell line JB6 could make JB6 cells form colony in soft agar and make nude mice into tumor. DNA sequencing and bioinformatics analysis showed that Tx gene contained human Immunoglobulin (Ig) kappa light chain gene fragment C region (constant region), J region (joining region), but no J area was found. Compared with the normal JC gene fragment of Ig kappa gene, we found that the Tx gene was 99% homology with it, so we speculated that Tx gene is an abnormal human Ig kappa light chain gene.
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R373;R739.63

【参考文献】