恒定磁场对Schwann细胞氧化损伤保护作用机理的实验研究

发布时间：2018-01-31 02:16

本文关键词： Schwann细胞恒定磁场氧化损伤　出处：《山东大学》2007年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 目的：长期以来，周围神经病变严重影响着人们的生活质量，是神经科学研究领域中的一个复杂但十分重要的病变过程。近年来的研究发现，其发病机理之一是氧化应激引起氧自由基增多，从而导致Schwann细胞的凋亡。Schwann细胞是周围神经系统特有的胶质细胞，包绕轴突形成有髓纤维或无髓纤维，并分泌多种与神经系统发育和再生密切相关的因子。近年来，通过外界因素(如各种神经生长因子、中药、电磁场、硅胶管及其他移植物等)干预Schwann细胞，进而促进周围神经损伤后再生的研究日趋增多。古今中外大量资料表明，磁场具有治病健身的作用。迄今已证实，外加磁场主要通过影响细胞类脂液晶膜层及细胞间的协调整合关系，对机体产生治病健身的作用。磁场通过多种方式应用于临床，如：静磁疗法、复合磁疗法、经络磁疗法和磁水疗法等。磁疗技术具有操作简单、见效快、副作用小、无痛苦等优点，能治疗多种疾病，如妇女痛经、颈椎病、癫痫病、精神疾病、青光眼、白内障、高血压和偏头痛等。磁场不仅能够促进毛细血管增生、促进表皮生长、加速溃疡愈合，还可以调整心血管功能，改善心脏病的血液循环，缓解心绞痛等。磁疗水可增加细胞的渗透性，提高消化酶的活性，增强消化功能；对结石的形成有抑制作用，对已形成的结石有溶解、促排作用，能治疗胆结石、胰腺结石、泌尿结石等。根据磁场与时间的关系，磁场可分为恒定磁场和变动磁场。恒定磁场具有恒定的磁场强度，是最基本、最简单的一种磁场，适合作基础性研究。目前，磁疗技术已在临床上广泛应用，但是人们对磁场治疗疾病的机理的认识还十分有限，而恒定磁场对Schwann细胞的抗氧化保护作用及其机制的研究尚未见报道。本课题通过建立过氧化氢诱导的Schwann细胞氧化损伤模型，并在此模型的基础上，观察4mT恒定磁场对氧化损伤的Schwann细胞的保护作用，通过MTT、生化检测、免疫组化等方法进行细胞活力测定、酶活力分析、Caspase-3的表达，探讨恒定磁场抗氧化损伤的作用机理，，为揭示恒定磁场治疗周围神经病变的机制提供理论依据。方法：本课题以72小时内新生Wistar大鼠的坐骨神经和臂丛神经为实验材料，用含10％胎牛血清的DMEM／F12培养液于5％CO_2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养。Schwann细胞培养24小时后，分为3个实验组，另设一空白对照组。 1．4mT恒定磁场的准备将两块磁铁上下依次放置，利用特斯拉计测定二者之间的空间磁场强度为4mT，然后将其放置于5％CO_2、37℃、饱和湿度的培养箱内。 2．Schwann细胞的纯化及鉴定阿糖胞苷抑制成纤维细胞及传代纯化雪旺细胞。实验前雪旺细胞爬片S-100免疫组化染色，鉴定雪旺细胞。 3．氧化损伤处理及恒定磁场处理细胞培养时分三组：①过氧化氢损伤组：终浓度为100μmol／L；②过氧化氢+恒定磁场保护组：100μmol／L H_2O_2+恒定磁场；③正常组(不加任何因素)；同时设仅加培养液的空白对照组。 4．MTT法进行恒定磁场抗过氧化氢氧化损伤的作用分析。 5．生化检测细胞内脂质过氧化物MDA和超氧化物歧化酶SOD水平。 6．应用免疫组织化学方法，测定正常对照组、过氧化氢损伤组及恒定磁场保护组三组细胞Caspase-3蛋白酶的变化。通过以上的实验，建立了过氧化氢诱导Schwann细胞的氧化损伤模型，在此模型的基础上探讨4mT恒定磁场对Schwann细胞抗氧化损伤保护作用的机理。结果：刚接种的原代Schwann细胞呈圆形，悬浮在培养液中，接种6h后大部分细胞贴壁，部分细胞开始呈椭圆形，24h后变成双极，胞体饱满，立体感强，少数呈三角形，伸出三个突起。培养48～72h后，出现聚合现象，许多细胞聚合在一起呈端对端、肩并肩、漩涡状或栅栏状排列，在细胞密度较低时，则聚集成堆，形成“细胞岛”，免疫细胞化学染色为S-100阳性；另一种细胞稍大，外形不规则，呈扁平状，突起短而多，核较浅，为成纤维细胞，所占比例较低。培养24小时后加终浓度为10~(-5) mol／L的阿糖胞苷，48小时后换液去除阿糖胞苷，镜下观察Schwann细胞的纯度明显增加，免疫化学染色显示80％以上的细胞S-100呈阳性反应。加入H_2O_212小时后，在倒置显微镜下观察发现细胞的形态发生改变，细胞突起萎缩，胞体肿胀变圆，细胞数量减少，部分细胞脱壁漂浮于培养液中，胞体立体感差，折光度下降，并可见大量细胞碎片；恒定磁场保护组的细胞生长状态良好，胞体饱满立体感强，少见细胞皱缩破碎现象，但细胞聚团现象较明显；正常组的细胞状态长势很好。不同实验组检测结果如下： 1．MTT法进行恒定磁场抗氧化损伤的作用分析表明：恒定磁场可明显拮抗过氧化氢诱导的氧化损伤，与过氧化氢损伤组相比，恒定磁场保护组可维持较高的细胞存活率，二者之间有统计学意义(P＜0.05)，恒定磁场保护组的细胞细胞存活率虽然低于正常组，但无统计学意义。 2．生化检测表明：与过氧化氢损伤组相比，恒定磁场保护组细胞内超氧化物歧化酶(SOD)维持在较高的活力水平，表明恒定磁场可明显拮抗过氧化氢引起的SOD降低；同时低于正常对照组，有统计学意义(P＜0.05)。 3．生化检测表明：与正常组相比，过氧化氢引起细胞内脂质过氧化物的大量堆积，而恒定磁场可明显降低细胞内脂质过氧化物的含量(P＜0.05)。 4．免疫组织化学法检测细胞内Caspase-3的表达：正常组Schwan细胞的Caspase-3反应呈弱阳性，细胞内棕色颗粒几乎没有；过氧化氢损伤组呈强阳性，可见到阳性的棕色颗粒；恒定磁场保护组呈弱阳性，棕色颗粒很少。结论：我们以原代培养的Schwann细胞为实验材料，过氧化氢诱导Schwann细胞的氧化损伤为模型，在此模型的基础上，观察过氧化氢诱导Schwann细胞的氧化损伤作用及恒定磁场对氧化损伤的Schwann细胞的保护作用。实验结果显示：过氧化氢损伤能够引起细胞内自由基的增多，SOD活力的降低，脂质过氧化物的增多，并且自由基的增多能通过信号通路上Caspase-3最终引起细胞的凋亡；恒定磁场则能够降低细胞内脂质过氧化物(MDA)的含量，维持细胞内超氧化物歧化酶(SOD)的含量，还能通过降低凋亡蛋白酶Caspase-3来影响死亡事件的发生，证明4mT恒定磁场可以明显拮抗过氧化氢对Schwann细胞的氧化损伤作用。本研究是对4mT恒定磁场对Schwann细胞氧化损伤保护作用机理的实验研究，首次分析确定了恒定磁场抗氧化损伤的作用机制，为研究恒定磁场在周围神经病变中的治疗作用提供了一定的理论依据。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R35

【参考文献】

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