杜氏利什曼原虫amastin基因DNA疫苗的初步研究

发布时间：2018-02-19 23:48

本文关键词： 杜氏利什曼原虫 DNA疫苗 amastin基因 ctxB基因　出处：《四川大学》2007年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani，L．d)引起的内脏利什曼病(visceral leishmaniasis，VL，又称黑热病)是利什曼病中症状最严重的一种类型，如不经治疗，病死率达90％以上。据WHO／TDR资料，全世界每年新增加50万内脏利什曼病病人，患病人数约250万。目前，对内脏利什曼病采取的主要控制措施仍然是使用葡萄糖酸锑钠(五价锑剂)等药物治疗病人或捕杀病犬以控制传染源，其次是使用驱虫剂或杀虫剂避免被传播媒介白蛉叮咬。然而，抗内脏利什曼病药物普遍存在用药时间长、副作用明显、不能口服以及治疗费用昂贵，，绝大多数发展中国家的病人无力承担等问题。近年来，在一些发病地区甚至产生了针对葡萄糖酸锑钠的抗药株，加上艾滋病与内脏利什曼病混合感染情况的出现，使内脏利什曼病的防治形势更加严峻。因此，研制出安全、有效、使用费用低廉的可供临床大规模应用的疫苗，对于控制内脏利什曼病具有十分重要的现实意义。近年来，被称为第三代疫苗的核酸疫苗的出现，为内脏利什曼病疫苗的研究提供了一个新的发展方向。目前，在此方面已有尝试性的研究报道。本研究在查阅国内外大量文献的基础上，首次选用杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白(amastin)基因作为疫苗候选基因，并首次设计将霍乱毒素B亚单位(CTB)的编码基因ctxB与amastin基因融合，构建了含amastin基因的两种DNA疫苗，免疫接种实验小鼠，对它们的免疫原性和免疫保护性以及CTB的佐剂作用进行了初步评价。本研究共分为五部分：第一部分，以两株杜氏利什曼原虫基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得了与预期大小一致、约552bp的杜氏利什曼原虫amastin基因。将amastin基因定向克隆入原核表达载体pET-32a(+)，构建原核表达重组质粒pET-amastin和pET-dog-amastin，进行测序和序列对比分析，并诱导pET-amastin在原核系统中表达出约40kD的融合蛋白。第二部分，利用重叠PCR技术将ctxB基因与amastin基因进行融合，得到ctxB／amastin融合基因，并将ctxB／amastin融合基因定向克隆入原核表达载体pET-32a(+)，构建原核表达重组质粒pET-ctxB／amastin，诱导pET-ctxB／amastin在原核系统中表达出约54kD的融合蛋白。第三部分，将amastin基因和ctxB／amastin融合基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-amastin和pcDNA3.1-ctxB／amastin，将pcDNA3.1-amastin和pcDNA3.1-ctxB／amastin体外转染NIH3T3细胞后，用免疫荧光法检测到有效的瞬时表达，经G418筛选后存活的转染细胞的总RNA经RT-PCR分别扩增出约552bp和921bp的目的条带，证实转入基因得到稳定表达；Western blot检测到转染的阳性细胞克隆稳定表达出20kD和34kD的目的蛋白。第四部分，将构建的真核表达重组质粒用作DNA疫苗免疫BALB／c小鼠，检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4产生水平以及CTL杀伤活性等指标，评价疫苗的免疫原性。结果发现：pcDNA3.1-amastin和pcDNA3.1-ctxB／amastin免疫组的免疫原性均高于空白质粒对照组(P＜0.01)；pcDNA3.1-ctxB／amastin免疫组的体液免疫和细胞免疫水平均高于pcDNA3.1-amastin免疫组，单因素方差分析显示，差异有显著性(P＜0.01)。第五部分，将构建的真核表达重组质粒用作DNA疫苗免疫BALB／c小鼠，加强免疫后，用杜氏利什曼原虫前鞭毛体对免疫小鼠进行攻击，攻击6周后处死小鼠，取肝、脾印片检查无鞭毛体数量情况，并做组织切片观察肝、脾病理形态学变化，评价疫苗对动物的免疫保护性。结果发现：pcDNA3.1-amastin和pcDNA3.1-ctxB／amastin免疫组小鼠肝、脾印片的无鞭毛体数量均低于空白质粒pcDNA3.1(+)免疫组，pcDNA3.1-ctxB／amastin免疫组小鼠肝、脾印片的无鞭毛体数量低于pcDNA3.1-amastin免疫组。pcDNA3.1-amastin和pcDNA3.1-ctxB/amastin免疫组小鼠肝、脾病理变化明显低于空白质粒pcDNA3.1(+)免疫组。结果表明：含amastin基因的两种DNA疫苗均可在小鼠体内产生一定的免疫保护效应，ctxB/amastin融合基因免疫组的免疫保护效果似乎强于单纯的amastin基因免疫组。本研究结果表明：含amastin基因的两种DNA疫苗具有较强的免疫原性，能诱导BALB／c小鼠产生一定程度的抗杜氏利什曼原虫感染保护性免疫力，加入佐剂分子CTB的疫苗免疫原性和免疫保护性优于单纯的amastin基因疫苗免疫组。而且，ctxB／amastin融合基因免疫可诱导产生更强的细胞免疫应答。由于杜氏利什曼原虫为胞内寄生原虫，细胞介导的免疫效应能够抑制虫体的增殖，对于抵御杜氏利什曼原虫起着极其重要的作用，因此，构建疫苗候选基因与佐剂分子的融合基因在内脏利什曼病DNA疫苗研究中的意义更为突出。迄今为止，该研究未见国内外报道。本研究为进一步研制安全、有效的内脏利什曼病疫苗奠定了基础。
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【学位授予单位】：四川大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【引证文献】