人法尼酯X受体基因转录调控的研究

发布时间：2018-02-26 05:04

  本文关键词： 法尼酯X受体 肝细胞核因子1α 启动子 葡萄糖　出处：《第三军医大学》2007年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 法尼酯X受体(farnesoid X receptor,FXR)因其天然配体为胆汁酸,又称为胆汁酸受体,是一种配体依赖性转录因子,属于核受体超家族的一员。FXR主要表达于肝脏、小肠、肾及肾上腺等组织,在心脏和脂肪组织中也有一定水平的表达。FXR可与视黄酸X受体(retinoid X receptor, RXR)以异二聚体形式结合于靶基因启动子的FXR反应元件,参与多种基因表达的调控,在胆汁酸负反馈调节、糖脂代谢中发挥重要作用。目前,FXR研究的重点主要集中在寻找FXR新的配体、靶基因以及探讨其与核受体辅活化子之间相互作用等,对FXR转录调控的研究鲜有报道。事实上,FXR自身表达水平的改变是影响脂代谢平衡的重要因素,而FXR转录调控的机制至今尚不清楚。许多参与碳水化合物代谢调节的基因都受葡萄糖或胰岛素正性或负性调节。有研究表明葡萄糖也能调控FXR基因的转录。为研究FXR基因的转录调控,探讨高糖条件下FXR表达增高的机制,我们进行了如下的研究: 1.FXR启动子生物信息学分析及转录起始位点的确定 预测软件(http://www.fruitfly.org/ cgi-bin/seq_tools/promoter.pl.)提示,FXR基因5′侧翼区的启动子样序列位于外显子上游约1600bp范围内。应用transFac professional 8.1软件对该区域进行搜索,获得了多个可能的转录因子结合位点,其中一个重要的结合位点是与细胞核因子1α(hepatocyte nuclear factor 1α, HNF1α)的结合位点。5′端cDNA末端快速扩增法(rapid amplification of cDNA ends, RACE)确定转录起始点的碱基为A。该转录起始点位于翻译位点前380bp处,比已知的FXR_mRNA(U68233、NM005123)5′端第一个碱基长29 bp。 2.FXR启动子的活性分析 构建包含FXR基因5′上游序列的荧光素报告质粒,利用脂质体瞬时转染肝细胞系,检测荧光素酶活性。结果显示启动子活性最小区域位于 150/+29bp,其中-150～-74bp间存在较强的正性调控序列。定点突变实验进一步证明-89～-84区域在FXR启动子中发挥重要作用。 3.体内、体外鉴定HNF1α与FXR启动子活性区域的结合 染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)及电泳迁移率变动实验(electrophoresis mobility shift and supershift assay, EMSA)实验证明:HNF1α可在体内、外与FXR启动子区域相结合。 4.HNF1α调节FXR的转录活性 HNF1α真核表达质粒与FXR启动子重组报告基因载体或与突变体的共转染实验表明,HNF1α通过与FXR启动子-89～-84区域结合,调控FXR启动子的活性。Real time PCR和免疫印迹试验(western blot, WB)证明:高表达HNF1α可上调HepG2细胞中FXR的表达。 5.葡萄糖对胆汁酸受体基因启动子的调节 在分析FXR启动子活性区域及鉴定相关转录因子基础上,探讨葡萄糖对FXR基因表达的转录调控机制。实验结果显示,高糖作用下FXR启动子活性增高, HepG2细胞内HNF1α结合于FXR启动子的活性增高;高糖能够上调HepG2细胞内FXR及HNF1α的表达。结果表明高糖诱导的FXR表达水平增加可能与HNF1α介导的FXR启动子活性的增强有关。 本研究对人FXR基因5′侧翼序列进行了系列缺失分析,鉴定了启动子的活性区域,发现并证实了与之结合的转录因子HNF1α。在上述实验结果的基础上,我们还探讨了葡萄糖在转录水平调控FXR表达的机制。FXR启动子的鉴定及转录调节的研究,对于我们深入认识FXR基因自身转录调控以及FXR在生物体内的生理和病理作用具有重要意义。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R346

【共引文献】

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本文编号：1536600