产尿毒素分解酶基因工程菌的构建

发布时间：2018-03-19 04:10

  本文选题：基因克隆　切入点：基因工程菌　出处：《中南大学》2007年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 目的： 将尿酸氧化酶基因克隆到乳酸杆菌中，使之能产生尿酸氧化酶，为一菌多基因克隆打下基础。 方法： 从产朊假丝酵母菌中提取基因组DNA，根据genbank上已知的该菌尿酸氧化酶基因序列，设计引物PCR扩增尿酸氧化酶基因片段，将其克隆入质粒pMG36e，构建成重组质粒PMG36e-U，并转化大肠杆菌DH5α，筛选鉴定，提取重组质粒PMG36e-U，把重组质粒电穿孔转化保加利亚乳酸杆菌，SDS-PAGE鉴定基因工程菌体裂解液中的尿酸氧化酶，并测定尿酸氧化酶的活性。 结果： 1．从产朊假丝酵母基因组中扩增到的尿酸氧化酶基因片段长度为0.9kb。 2．构建的含重组质粒pMD18-T-U的大肠杆菌，用XhaⅠ和HindⅢ双酶切及菌落PCR鉴定，并测序鉴定，基因片段序列与genebank上尿酸氧化酶基因序列完全一致。 3．用含2.5μg／mL的红霉素MRS培养基筛选到用重组质粒pMG36e-U成功转化的重组保加利亚乳酸杆菌。 4．重组保加利亚乳酸杆菌经不连续SDS-PAGE分析，表达重组蛋白的分子量约为34KD，，与从尿酸氧化酶基因序列推测的303个氨基酸的理论分子量相符。 5．在体外测定用DEAE DE52纤维柱纯化后的重组保加利亚乳酸杆菌酶液，酶活性可达0.39u／mL，较原始菌株稍低。 结论： 尿酸氧化酶基因克隆入保加利亚乳酸杆菌中，并具有酶分解能力。 目的： 将肌酐水解酶基因克隆到保加利亚乳酸杆菌中，使之能产生肌酐水解酶，为一菌多基因克隆打下基础。 方法： 从恶臭假单胞菌中提取基因组DNA，根据genbank上已知的恶臭假单胞菌肌酐水解酶基因序列，设计引物PCR扩增肌酐水解酶基因片段，将其克隆入质粒pMG36e，构建成重组质粒PMG36e-C，并转化大肠杆菌DH5a，筛选鉴定，提取重组质粒PMG36e-C，把重组质粒电穿孔转化保加利亚乳酸杆菌，SDS-PAGE鉴定基因工程菌体裂解液中的肌酐水解酶，并测定肌酐水解酶的活性。 结果： 1．从恶臭假单胞菌基因组中扩增到的肌酐水解酶基因片段在小为0.78kb。 2．构建的含重组质粒pMD18-T-C的大肠杆菌，用XhaⅠ和HindⅢ双酶切及菌落PCR鉴定，并测序鉴定，基因片段序列与genebank上肌酐水解酶基因序列完全一致。 3．用含2.5μg／mL的红霉素MRS培养基筛选到重组质粒pMG36e-C成功转化的重组保加利亚乳酸杆菌。 4．重组保加利亚乳酸杆菌经不连续SDS-PAGE分析，表达重组蛋白的分子量约为28KD，与从肌酐水解酶基因序列推测的260个氨基酸的理论分子量相符。 5．在体外测定用DEAE DE52纤维柱纯化后的重组保加利亚乳酸杆菌酶液，酶活性可达0.19 u／mL，较原始菌株稍低。 结论： 肌酐水解酶基因克隆入保加利亚乳酸杆菌中，并具有酶分解能力。
[Abstract]:Objective:. The uric acid oxidase gene was cloned into Lactobacillus to produce uric acid oxidase. Methods:. Genomic DNA was extracted from Candida prion. According to the known gene sequence of uric acid oxidase in genbank, a primer PCR was designed to amplify the gene fragment of uric acid oxidase. The recombinant plasmid was cloned into pMG36e. the recombinant plasmid PMG36e-U was constructed and transformed into E. coli DH5 伪. The recombinant plasmid PMG36e-U was extracted by electroporation. The recombinant plasmid was electroporated into Lactobacillus bulgaricus SDS-PAGE to identify the uric acid oxidase in the lytic fluid of genetically engineered bacteria. The activity of uric acid oxidase was determined. Results:. 1. The length of uric acid oxidase gene amplified from the genome of Candida prion was 0.9kb. 2. Escherichia coli containing recombinant plasmid pMD18-T-U was digested by Xha 鈪

本文编号：1632754