新生儿缺氧缺血脑损伤大鼠模型制备以及间充质干细胞对模型损伤疗效的研究

发布时间：2018-04-04 14:07

  本文选题：新生儿脑缺氧缺血性脑病　切入点：TTC染色　出处：《南方医科大学》2016年硕士论文

【摘要】：研究背景及目的：缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage. HIBD)是因脑组织部分或完全缺氧、脑血流量减少或暂停导致的脑损伤,最终可造成神经细胞的凋亡和坏死。新生儿缺氧缺血性脑病(Hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)是由于围产期窒息缺氧所引起的脑损伤,严重者可造成永久性神经功能损害,是儿童神经系统损伤的常见原因之一。缺氧缺血的主要病因是围产期的窒息,窒息是由于母体和胎儿的血液循环障碍和气体交换障碍,导致血氧的浓度降低。宫内窒息的发生率占50%,分娩过程中窒息率占了40%,其他原因占了10%。由于新生儿脑代谢很旺盛,全身耗氧量的一半为脑耗氧量并且脑内的糖原含量很少,所以氧和葡萄糖全都要靠脑部血液循环提供,当机体缺氧缺血,脑组织会发生以下改变：1、能量代谢会发生障碍：由于缺氧时候,脑组织的酵解力增强5-10倍,就会引发代谢性的酸中毒；2、通气功能的改变：二氧化碳贮留,使PaCO2增强,就会引发呼吸性的酸中毒；3、脑内的无氧代谢使ATP的产生大量降低,一种原因是因为能量的来源不充足,使脑的氧化代谢受到了非常大的损害,神经元大量坏死。而另一种原因是钠泵转运功能障碍,脑细胞内部的氯化钠水平上升,导致细胞内发生水肿现象；4、脑部的微血管缺氧及血流减少,则引起脑的缺血,并引起血管的通透性的升高进而产生血管源性的脑水肿：5、当缺氧缺血后引起再灌注的损伤、钙离子超负荷和氧自由基的增多,氨基酸兴奋、并且大量释放各种细胞因子,诱发一系列的复杂的级联反应,造成神经元损伤。该病的病理基础是缺氧缺血性损伤。缺氧主要会引起脑水肿及神经元坏死,缺血主要引起脑血管梗塞以及白质软化。临床表现：1、足月新生儿、具有临床上可以诊断的宫内窘迫史或着新生儿的产时窒息的情况；2、出现程度不同的意识改变,轻者会出现激惹或者嗜睡,重者出现昏迷；3、患儿的前囟饱满、头围会变大、骨缝有分离,出现脑水肿的表现；4、肌张力的改变；5、惊厥：中、重症多见,惊厥可以表现为阵挛型样表现和强直性肌阵挛型表现,发作次数不规律,一般会在在生后24小时发作,发作者在24小时以内的后遗症发生率明显升高;6、原始反射的异常：比如拥抱反射活动会异常活跃、有时则会减弱或消失。吸吮反射活动有时减弱或者消失；7、重症患儿会出现呼吸衰竭,常常伴有有呼吸节律不齐、呼吸暂时停止、以及眼球的震颤、瞳孔大小的改变等脑干损伤的表现,重度表现的HIE患儿即使可以存活下来,也会常常患有智力障碍、脑瘫、癫痫等严重的后遗症。[4，，5]当前在临床上针对于HIE的治疗方法主要是护理及支持疗法。一直以来,探索和研发治疗HIE的有效的药物,是新生儿科医学领域研究的非常紧迫的任务。近几年来,间充质干细胞不论是在胚胎中或者是在成年个体的神经系统中的发现以及体外培养成功为缺氧缺血性脑病的细胞移植治疗和基因治疗,提供了新的方法在了解这些治疗方案疗效及其作用机制的研究中,HIE动物模型起到了非常重要的作用。在高原地区,大气氧分压较低,由于高原低氧的影响,新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)在高原地区发病率比较高。本实验采用高原低压环境模拟仓结合大鼠游泳运动的方法制备高原地区新生儿缺氧缺血性脑病大鼠模型,观察其行为学、脑组织病理变化、脑TTC染色和电镜下红细胞形态观察,为HIE在高原地区的临床研究做基础实验准备。方法：将SD新生大鼠(10日龄)32只,随机分为4组：对照组为A组,实验组：B组(2000m组)、C组(4000m组)、D组(6000m组)。对照组大鼠在屏障环境中饲养,实验组大鼠置于高原低压环境模拟仓结合运动的方式在舱内游泳槽进行60 min/d的游泳运动,且在高原低压环境模拟舱内生活时间每天不少于20小时。每组大鼠分别在第3、7、11、15d用Zea Longa 5分制评分标准进行行为学评分并且于第15d采集静脉血,在扫描电镜下观察红细胞形态。每组处死后取脑组织进行HE染色和TTC染色。模型制作成功后,分为3组即对照组：8只：HIE+PBS组(模型组)：8只,先制成HIE模型,然后给予PBS作为安慰治疗；HIE+MSC组(治疗组)：8只,先制成HIE模型,然后给予MSC治疗。分别于干预后第5、7、14、21天进行神经行为学检测(Rotarod Test旋转实验和Morris水迷宫测试)。21日后处死采用组织切片HE染色,观察新生大鼠脑损伤的病理变化。结果：1、神经病学评分对照组行为正常,在行为学评分中为0分,而实验组大鼠行为学异常,主要表现为一侧肢体感觉和运动功能障碍和平衡功能的异常。实验组大鼠评分随海拔升高而升高,行为异常程度与海拔高度呈正相关。并且实验组大鼠在第3、7、11、15d行为学评分逐渐升高,这一数据表明长期生活中缺氧环境中会使脑损伤程度日趋加重,实验表明对照组与各实验组差异有显著性意义p0.05)海拔6000m组与对照组比较差异非常显著(p＜0.01)。2、脑组织病理学改变对照组脑组织神经细胞、神经胶质细胞大小、外形正常,未出现脑水肿;在海拔2000m大脑皮质轻度萎缩,神经元细胞轻度水肿,胶质细胞轻度增生：在海拔4000m大脑皮质中度萎缩,神经元细胞中度水肿,胶质细胞中度增生；在海拔6000m室管膜细胞重度水肿。3、TTC染色结果TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)是脂溶性光敏感复合物,它是呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统的质子受体,与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色,而缺氧缺血组织内脱氢酶活性下降,不能反应,故不会产生变化呈苍白[16]。对照组TTC染色结果为红色,未出现缺氧缺血表现；海拔2000m出现轻度改变,大脑皮质出现小片苍白；海拔4000m大脑皮质区可明显看见苍白区域；海拔6000m接近一半出现苍白区。利用Image-Pro Plus做出海拔2000m组脑缺氧面积为26.6%,海拔4000m组脑缺氧面积为34.3%,海拔6000m组脑缺氧面积为56.6%,而对照组则为正常。4、电镜下红细胞在扫描电镜下可以看见对照组红细胞呈双凹圆盘状,在海拔2000m下电镜表现为轻度改变呈帽状结构；在海拔4000m下表现为不规则形；在海拔6000m下表现为锯齿状,部分红细胞会出现空洞,崩解。间充质干细胞给予治疗：5、Rotarod Test结果显示造模后第5天模型组与治疗组大鼠在转轮中坚持时间明显下降,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)；造模后第7、14、21天,模型组与治疗组大鼠在转轮中坚持时间有升高趋势,其中治疗组升高趋势明显高于模型组(P0.05),第21天模型组与治疗组大鼠在转轮中坚持时间比较差异有统计学意义(P0.05)。6、Morris水迷宫结果显示3组大鼠的逃避潜伏期显示随训练天数增加而逃避时间逐渐缩短,前5天的总体学习成绩的组间差异有统计学意义(P0.01)。第7天开始治疗组时间逐渐缩短,第21天治疗组与模型组大鼠的逃避潜伏期在各个时间点的差异非常显著。7、病理结果：模型组大鼠出现海马区神经元水肿、核染色质结构不清、空泡形成等病理变化，而治疗组病理损伤明显减轻。结论：本研究采用高原低压环境模拟仓结合运动模拟高原环境制作新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)的模型,该模型稳定、可靠,比其他方法更符合缺血缺氧脑损伤的发病机理,与临床贴近,可用于相关研究。间充质干细胞治疗后发现间充质干细胞可促进大鼠缺血脑损伤后神经功能恢复。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742;R-332

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