热应激对小G蛋白RhoB的诱导作用、机制及生物学意义

发布时间：2018-06-23 20:13

  本文选题：热应激 + 烫伤　； 参考：《第二军医大学》2007年硕士论文

【摘要】： 热应激可由环境温度过高(如烧伤、烫伤)或体内的温度增高(如发热)所致,热应激可以激活多条细胞内的信号转导通路,促进应激基因的快速表达,以合成多种特异性和非特异性的对细胞具有保护作用的应激蛋白。小G蛋白RhoB是Rho亚家族的成员之一,国外近年来研究表明,RhoB是一个早期反应基因,能够被多种基因毒应激原,如放射线、紫外线、抗癌药(如5-氟脲嘧啶、顺铂)等诱导或使其激活。有报道RhoB上调能够促进细胞存活、抑制细胞凋亡。但是作为非基因毒应激的热应激是否影响RhoB的表达未见报道。本课题从在体和离体两个水平观察了热应激对RhoB表达的影响,并进一步研究了RhoB表达改变的机制以及可能的生物学意义,以期为临床烧伤、烫伤等疾病的救治提供新的靶点。 一、烫伤和热应激能够上调RhoB的表达 首先制备了30%体表面积III度烫伤大鼠模型,采用RT-PCR及Western blot方法检测了肝和肺组织中RhoB mRNA及蛋白的表达情况。结果发现,大鼠肝,肺组织中RhoB mRNA在烫伤后2h时即上调,4h时达到最大值,约为对照组的3～4倍(p0.01)。由于烫伤后体内会产生一系列的神经内分泌反应,而我们以往的实验已证实糖皮质激素(GC)可以诱导RhoB的表达。为排除体内的神经内分泌因素,确定热应激本身是否可直接上调RhoB,我们进一步观察了热应激对体外培养的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞和人前列腺癌细胞系PC-3细胞中RhoB表达的影响。结果显示,热应激本身能以时间依赖性的方式快速地诱导这两种体外培养细胞中RhoB mRNA和蛋白的表达。表明热刺激在体内和体外都可以上调RhoB的表达,这种作用无明显的组织细胞特异性。 二、热应激上调RhoB表达的机制研究 以RAW264.7细胞模型,我们对热应激上调RhoB表达的机制进行了初步探讨。我们用放线菌素D抑制RAW264.7细胞的转录,观察了热应激对RhoB mRNA的稳定性的影响,以明确热应激诱导RhoB表达发生在转录水平,还是在转录后水平,结果显示,在RAW264.7细胞中热应激能使RhoB的半衰期由3.98h增加至7.6h(p0.01),表明热应激RhoB mRNA的增加主要由RhoB的稳定性增加所致。 已证实p38 MAPK信号通路能被包括热应激在内的多种应激原激活,我们因而观察了p38 MAPK的抑制剂SB203580对热应激诱导细胞RhoB表达的影响。结果显示,于RAW264.7细胞的培养液中加入SB203580抑制p38 MAPK的激活后,再将细胞进行热应激处理,RhoB的诱导水平比没经SB203580处理细胞降低了约50%,表明p38 MAPK通路参与了热应激对RAW264.7细胞RhoB的诱导作用。 三、RhoB上调对SGK和HSP70表达的影响 血清和糖皮质激素调节蛋白激酶(serum and glucocorticoid-regulated protein kinase,SGK)是一个与PI-3K下游的PKB/AKT具有高度同源性的蛋白激酶,能被糖皮质激素、血清以及多种应激原所诱导,在细胞增殖、细胞存活和凋亡的信号转导中起重要的作用。本实验显示,在RAW264.7细胞中,SGK也能被热应激所诱导。因此我们进一步观察了RhoB表达量的改变对SGK的影响,结果显示转染RhoB-wt质粒使RhoB过表达的细胞热应激后,SGK mRNA的表达量比转染空载体的细胞明显增高(约2.1倍,p0.01),相反通过转染siRhoB质粒抑制RhoB表达的细胞热应激后SGK mRNA的表达量明显减少。表明在热应激后,RhoB的上调可能通过使SGK的表达增多,在热应激时起促进细胞存活的作用。 热应激能够诱导热休克蛋白(HSPs)的表达,HSP对于维持细胞生存、促进细胞生存具有重要的作用。我们采用上述同样的方法观察了热应激前后RhoB表达量的改变对HSP70表达的影响,结果表明热应激时RhoB表达量的改变不影响HSP70 mRNA的表达。 综上述,本实验发现,热应激能够在整体水平和细胞水平诱导RhoB的表达,这种诱导没有明显组织和细胞的特异性,热应激能够明显提高RhoB的稳定性, p38 MAPK通路激活参与了RhoB表达的上调。RhoB的上调能够促进SGK的表达,但不影响HSP70的表达,这些都显示出RhoB具有细胞应激蛋白的特征。
[Abstract]:In recent years , it has been shown that RhoB is an early reaction gene which can be used to synthesize many kinds of specific and non - specific stress proteins , such as radiation , ultraviolet , anti - cancer drugs ( such as 5 - fluorouracil and cisplatin ) .






One , scald and heat stress can up - regulate the expression of RhoB






The expression of RhoB mRNA and protein in liver and lung tissues was detected by RT - PCR and Western blot .






Study on Mechanism of Up - regulation of RhoB Expression by Heat Stress






Using RAW264.7 cell model , we discussed the mechanism of up - regulation of RhoB expression by heat stress . The effect of heat stress on the stability of RhoB mRNA was observed by actinomycin D . The results showed that heat stress induced RhoB expression to increase from 3.98 h to 7.6 h ( p0.01 ) . The results showed that the increase of RhoB mRNA in RAW264.7 cells was mainly caused by the increase of RhoB .






It has been shown that p38 MAPK signal pathway can be activated by various types of stress including heat stress , and we have observed the effect of p38 MAPK inhibitor SB203580 on the expression of RhoB in heat stress induced cells . The results showed that the activation of p38 MAPK was inhibited by adding SB203580 to the culture solution of RAW264.7 cells . The induction of RhoB was reduced by about 50 % compared with that without SB203580 , suggesting that p38 MAPK pathway was involved in the induction of RAW264.7 cells RhoB .






The Effect of RhoB on the Expression of SGK and HSP70






Serum and glucocorticoid - regulated protein kinase ( SGK ) is a protein kinase with high homology with PKB / A downstream of PI - 3K . SGK plays an important role in the signal transduction of cell proliferation , cell survival and apoptosis .






Heat stress can induce the expression of heat shock protein ( HSPs ) , and HSP plays an important role in maintaining cell survival and promoting cell survival . The effect of the change of RhoB expression level before and after heat stress on the expression of HSP70 was observed by the same method . The results showed that the change of RhoB expression in heat stress did not affect the expression of HSP70 mRNA .






These results show that heat stress can induce RhoB expression at the whole level and cell level . This induction has no obvious tissue and cell specificity . Heat stress can obviously improve the stability of RhoB , and p38 MAPK pathway is involved in the up - regulation of RhoB expression . The up - regulation of RhoB can promote the expression of SGK , but it does not affect the expression of HSP70 , which show that RhoB has the characteristics of cell stress protein .
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R363

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本文编号：2058261