rAAV介导TPO基因修饰的骨髓MSCs对巨核系造血生成的作用研究

发布时间：2018-07-04 21:56

  本文选题：间质干细胞 + 条件培养液　； 参考：《中南大学》2007年博士论文

【摘要】： 目的：对于肿瘤患者在接受高剂量放疗、化疗后，或非化疗的病人如骨髓异常增生综合征，先天性血小板减少性紫癜，慢性肝脏疾病等，血小板减少症引起的出血是患者死亡的主要原因之一。血小板输注治疗是目前严重血小板减少症的唯一的紧急治疗措施。但是，血小板输注仍然存在如异体免疫反应，感染抗原的传播，输注反应等严重的问题。因此，本研究拟通过rAAV介导TPO基因修饰骨髓MSCs，并探讨其对巨核系造血的作用。 方法与结果： 1．骨髓间质干细胞的分离与培养 本研究采用密度梯度离心法结合贴壁法体外培养获取人骨髓MSCs，分别诱导MSCs向成骨和成脂肪分化，采用Von Kossa法和油红0染色分别检测诱导后的成骨细胞和脂肪细胞。结果表明通过体外原代和传代培养获得高效扩增能力的MSCs，随着传代次数的增加，细胞的增殖能力下降。向成骨诱导2周左右Von Kossa法染色可见大量黑色钙盐沉积；向成脂诱导3周油红0染色显示大量红色脂滴。 2．骨髓MSCs条件培养液对诱导人巨核细胞系Meg-01细胞分化的作用 收集骨髓MSCs的条件培养液(MSCs-CM)，将MSCs-CM加入早期巨核祖细胞Meg-01细胞系的培养体系中，诱导Meg-01巨核细胞系分化成熟。NF-E2表达是巨核细胞生成血小板所必需的，RT-PCR结果表明，MSCs-CM处理的Meg-01细胞系NF-E2表达增强，说明MSCs-CM能促进巨核细胞分化成熟。Altas cDNA expression array结果表明，与对照组比较(无MSCs-CM作用的Meg-01细胞)，MSCs-CM作用的Meg-01细胞中7个基因表达上调，5个基因表达下调。通过对差异表达的基因进行分析，其中与细胞周期中有丝分裂有关的基因，如microtubule-associated protein、CDC20表达下调；与细胞内Ca~(2+)相关细胞内信号传导分子，如calcium／calmodulin-dependent prote in kinaseⅣ表达上调，与JAK3途径有关细胞内信号传导分子，如Janus kinase 3表达上调；与凋亡相关的基因tumor necrosis factor、adenosine A1 receptor表达上调；巨核细胞分化成熟的基因PDGF-A表达上调。这些结果为进一步研究MSCs-CM对巨核细胞的调节作用提供了分子基础。 3．骨髓MSCs条件培养液联合TPO或IL-11对巨核系细胞体外生成的影响 有文献报道血小板生成素(thrombopoietin，TPO)或白细胞介素11(interleukin-11，IL-11)是有效促进巨核细胞生成的细胞因子，本研究中比较骨髓MSCs-CM，MSCs-CM联合TPO或MSCs-CM联合IL-11对体外培养条件下骨髓来源的巨核系细胞生成的影响。结果表明：MSCs-CM，MSCs-CM联合TPO或MSCs-CM联合IL-11均能促进巨核系祖细胞和成熟巨核细胞的生成。与MSCs-CM单用或TPO单用比较，MSCs-CM和TPO联用后对巨核系祖细胞和成熟巨核细胞的生成有明显促进作用，TPO与MSCs-CM具有协同作用；而IL-11与MSCs-CM联合后，与MSCs-CM单用或IL-11单用比较，对巨核系细胞生成没有统计学差异，IL-11与MSCs-CM不具有协同作用。结果说明MSCs-CM与TPO联合培养体系将成为促进巨核系细胞生成的一种有效方法。 4．获取携带TPO基因的重组腺相关病毒载体 本研究中通过RT-PCR从人胎肝中扩增出1059bp大小的TPO基因，，将其克隆入pAAV-IRES-GFP质粒中，通过酶切和测序鉴定，成功地构建了重组pAAV-TPO-IRES-GFP(pAAV-TPO)质粒；然后采用磷酸钙共沉淀法将三质粒pAAV-TPO，pAAV-RC，pHelper共转染HEK293细胞，包装含有TPO基因的rAAV-TPO-IRES-GFP(rAAV-TPO)；通过“氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提”三步法纯化获得rAAV-TPO；通过SDS-PAGE蛋白电泳和点杂交检测，获得高纯度的滴度为2×10~(11)vg／ml的rAAV-TPO。然后，我们用rAAV-TPO-IRES-GFP(rAAV-TPO)转染MSCs，TPO基因修饰的MSCs在mRNA水平和蛋白水平TPO的表达明显增加，流式细胞仪检测其GFP的表达率为23.0％±7.18％。 5．rAAV介导TPO基因修饰的MSCs对巨核系细胞体外生成的影响 收集TPO基因修饰MSCs的条件培养液(TPO／MSCs-CM)，分析比较TPO／MSCs-CM和MSCs-CM对体外条件下诱导人骨髓来源的巨核系细胞生成的作用，结果表明，MSCs-CM和TPO／MSCs-CM均能促进巨核系祖细胞和CD41阳性表达的巨核细胞生成，其中TPO／MSCs-CM促进巨核系细胞生成的作用明显强于MSCs-CM，说明用rAAV作为载体介导TPO基因修饰的骨髓MSCs(TPO／MSCs)有望成为促进巨核系细胞生成的安全有效的新方法。 6．共移植TPO基因修饰的MSCs对NOD／SCID小鼠巨核系造血生成的作用 在体外实验的基础上，我们用NOD／SCID小鼠实验进一步深入探讨TPO／MSCs对巨核系细胞生成的作用。经X射线照射后的NOD／SCID小鼠，输注人骨髓单个核细胞(Mononuclear cells，MNCs)，同时共移植人骨髓来源的MSCs或者TPO基因修饰的MSCs(TPO／MSCs)，比较TPO／MSCs或MSCs对动物体内巨核系细胞生成的作用。结果表明：MSCs与MNCs或TPO／MSCs与MNCs共移植小鼠后，在小鼠的各个组织(包括骨髓、外周血、脾脏和肝脏)中能检测到人源细胞的Alu序列基因。共移植MSCs与MNCs或TPO／MSCs与MNCs后在骨髓和外周血中对人CD45阳性细胞植入率没有差别。共移植MNCs与MSCs或MNCs与TPO／MSCs后，在小鼠骨髓中人源CD41阳性巨核细胞分别为0.98±0.65％和3.46±1.73％；小鼠骨髓每2×10~5个单个核细胞生成的CFU-MK数分别为6.20±3.70和20.40±7.16；用HE染色后观察成熟多倍体巨核细胞，骨髓中分别为3.40±1.14和12.60±5.45、脾脏中分别为2.20±0.84和6.80±1.64、肝脏中分别为0和0.80±0.44。此外，移植后每3天计数外周血血小板数，结果表明共移植MSCs与MNCs或TPO／MSCs与MNCs均能促进小鼠体内血小板生成；并且TPO／MSCs+MNCs组更能明显地减轻外周血血小板下降的程度，能保持血小板在一定水平，同时缩短血小板恢复的时间，更加快速地促进血小板的恢复。 结论：本研究在体外成功地分离培养出具有高效扩增能力和分化潜能的人骨髓MSCs；并且通过rAAV载体有效地介导TPO在MSCs中的表达，获得TPO基因修饰的MSCs(TPO／MSCs)；进一步研究表明TPO基因修饰的MSCs条件培养液(TPO／MSCs-CM)对于促进骨髓巨核系细胞生成的作用明显优于单独MSCs-CM，用TPO基因修饰的MSCs(TPO／MSCs)与骨髓单个核细胞(MNCs)共移植照射后的NOD／SCID小鼠，其对小鼠体内巨核系造血生成的作用明显优于共移植MSCs与MNCs。
[Abstract]:Objective : To study the effect of platelet transfusion on bone marrow MSCs by rAAV - mediated TPO gene modification of bone marrow MSCs .






Methods and Results :






1 . Isolation and Culture of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells






Human bone marrow MSCs were cultured in vitro by density gradient centrifugation combined with adherent method . The MSCs were induced to differentiate into bone and adipogenesis respectively .
A large number of red lipid droplets were stained with fat - induced 3 - week oil red 0 .






2 . Effect of conditioned medium of bone marrow MSCs on the differentiation of human cytomegalovirus Meg - 01 cells






The expression of NF - E2 in Meg - 01 cell line with MSCs - CM increased and the expression of NF - E2 in Meg - 01 cell line with MSCs - CM was regulated . The results showed that MSCs - CM - treated Meg - 01 cell line was up - regulated and 5 genes were down - regulated .
intracellular signaling molecules , such as calcium / calcium - dependent prote in kinase 鈪

本文编号：2097602