SYBR-Green1荧光定量PCR检测弓形虫B1基因实验方法的建立及应用
本文选题：弓形虫 + SYBR-Green1 ； 参考：《昆明医学院》2006年硕士论文
【摘要】：目的：建立SYBR-Green1荧光定量PCR(SYBR-Green1 qPCR)检测弓形虫的方法，并进行实验室方法学评价。方法：常规PCR扩增弓形虫RH株高度保守的B1基因部分序列，经TA克隆后转化入大肠杆菌JM109中。提取重组质粒PCR及测序鉴定后，作为阳性模板建立SYBR-Green1荧光定量PCR标准曲线，并做重复性试验，对桂弓、B36虫株及恶性疟原虫、血吸虫基因组DNA、30份孕产妇标本、200份无偿献血者标本进行检测。结果：用重组质粒制作的标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系，熔解曲线特异，相关系数0.997，平均试验间变异系数0.81％，检测桂弓、B36虫株均为阳性，而检测血吸虫、恶性疟原虫基因组DNA均为阴性：孕产妇检测阳性率16.7％，平均拷贝数为1.05×10~5／μl；对无偿献血者检测均为阴性。结论：成功建立了检测弓形虫B1基因的SYBR-Green1荧光定量PCR方法，较常规PCR技术更快捷、敏感、准确，，适合临床实验室及无偿献血者的筛查应用。
[Abstract]:Objective: to establish a method for the detection of Toxoplasma gondii by SYBR-Green1 fluorescent quantitative PCR (SYBR-Green1 qPCR) and evaluate the laboratory methodology. Methods: the highly conserved B1 gene of Toxoplasma gondii RH strain was amplified by routine PCR and transformed into E. coli JM109 by TA cloning. The standard curve of SYBR-Green1 fluorescent quantitative PCR was established as positive template after PCR and sequencing of recombinant plasmids, and the reproducibility test was carried out for the detection of B36 strain and Plasmodium falciparum strain of Plasmodium falciparum. The genomic DNA of Schistosoma japonicum was detected in 30 pregnant women and 200 free blood donors. Results: the standard curve cycle threshold of recombinant plasmids had a good linear relationship with template concentration. The fusion curve was specific, the correlation coefficient was 0.997, the average inter-test variation coefficient was 0.81%, and the detection of B36 strain was positive, but schistosoma japonicum was detected. The genomic DNA of Plasmodium falciparum was negative: the positive rate of maternal detection was 16.7g, the average copy number was 1.05 脳 10 ~ (5) / 渭 l, and that of free blood donors was negative. Conclusion: SYBR-Green1 fluorescence quantitative PCR method for detection of Toxoplasma gondii B1 gene was successfully established, which was more rapid, sensitive, accurate and suitable for screening clinical laboratory and blood donors.
【学位授予单位】：昆明医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R346
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