人IL-17F基因的克

发布时间：2018-07-21 16:19

【摘要】：目的:克隆人工IL-17F基因,在大肠杆菌中重组表达并构建人IL-17F转基因细胞和真核稳定表达,研究其生物学活性。 方法:分离人外周血单个核细胞,经PHA刺激后,提取细胞总RNA,根据GenBank公布的人IL-17F cDNA序列设计并合成一对引物,采用RT-PCR技术克隆人IL-17F基因,将其亚克隆到pUCm-T载体并鉴定。以测序正确的pUCm-T/hIL-17F为模板,PCR扩增出目的基因片段,并分别正向插入原核表达载体pGEX-5X-3和逆转录病毒载体pSIV-1,构建重组表达载体pGEX-5X-3/hIL-17F和pSIV-1/hIL-17F。重组原核表达载体pGEX-5X-3/hIL-17F导入大肠杆菌BL21并经IPTG诱导表达包涵体融合蛋白,纯化后进行Western印迹鉴定。MTT法分析GST-hIL-17F纯品蛋白对人脐静脉内皮细胞ECV304的生长抑制作用和ELISA法检测其对ECV304内皮细胞表达IL-6、IFN_γ和TNF-α的生物学作用,并采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)法分析其对血管形成的影响。重组逆转录病毒载体pSIV-1/hIL-17F与辅助病毒载体pHIT456和pHIT60混合后,脂质体法共转染包装细胞293T细胞。获得的具有感染能力的成熟重组逆转录病毒感染SMMC-7721肝癌细胞,经G418加压筛选获得抗性细胞株,并RT-PCR、Western blot检测目的基因的转录和表达。
[Abstract]:Aim: to clone the artificial IL-17F gene and express it in Escherichia coli and construct human IL-17F transgenic cells and eukaryotic cells to study its biological activity. Methods: human peripheral blood mononuclear cells were isolated and stimulated by PHA, the total RNAs were extracted. A pair of primers were designed and synthesized according to the cDNA sequence of human IL-17F published by GenBank. The human IL-17F gene was cloned by RT-PCR, subcloned into pUCm-T vector and identified. The target gene fragment was amplified by PCR using the correctly sequenced pUCm-Tr / hIL-17F, and was inserted into prokaryotic expression vector pGEX-5X-3 and retrovirus vector pSIV-1, respectively. The recombinant expression vectors pGEX-5X-3 / hIL-17F and pSIV-1 / hIL-17F were constructed. Recombinant prokaryotic expression vector pGEX-5X-3 / hIL-17F was introduced into Escherichia coli BL21 and induced by IPTG to express inclusion body fusion protein. After purification, the growth inhibition of GST-hIL-17F protein on human umbilical vein endothelial cells (ECV304) and the biological effects of GST-hIL-17F protein on the expression of IL-6, IFN- 纬 and TNF- 伪 in ECV304 endothelial cells were detected by Western blotting. The effect of chorioallantoic membrane (CAM) on angiogenesis was analyzed. The recombinant retroviral vector pSIV-1 / hIL-17F was mixed with the auxiliary virus vector pHIT456 and pHIT60, and then co-transfected into 293T cells by liposome method. SMMC-7721 hepatoma cell line was infected with mature recombinant retrovirus. The resistant cell line was obtained by G418 pressurization screening, and the transcription and expression of the target gene were detected by RT-PCRG Western blot.
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R392

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 王玉兰;陈祖琼;;对肿瘤坏死因子的新认识——TNF-α和-β的生物学活性比较[J];国际免疫学杂志;1988年06期

2 薛毅;用Ca(OH)_2处理细菌脂多糖后的生物学活性变化[J];国外医学.口腔医学分册;1995年02期

3 杨晓峰，马文煜，姜绍谆，逮好英;IL_2－HBVPre－S融合基因的克隆、表达及生物学活性初步鉴定[J];细胞与分子免疫学杂志;1996年02期

4 曹秀华;崔秀明;鲁玲;于瑞清;;1IL-16的合成分泌及生物学活性[J];国外医学(免疫学分册);1998年03期

5 锁孝坤,梁俊;白细胞介素的生物学活性及其应用[J];安徽教育学院学报(自然科学版);1999年02期

6 曹颖瑛,郑钦岳,姜远英,朱臻宇;胸腺素α1的基因合成、表达及活性测定[J];中国生物制品学杂志;2003年01期

7 林青,杨丕山;脱位牙保存液对其牙周膜成纤维细胞生物学活性的影响[J];山东医药;2005年15期

8 傅颖;梅松;来伟旗;王茵;;新生牛肝提取物生物学活性分析[J];医学研究杂志;2007年07期

9 曹传平;陈晓虹;吴建国;商阿丽;虞慧华;康五朋;郑玲莉;张敬;鞠佃文;;胰岛素样生长因子-1基因原核表达载体的构建及表达蛋白的生物学活性[J];中国生物制品学杂志;2008年10期

10 裴德宁;饶春明;李永红;韩春梅;任跃明;王军志;;重组抗肿瘤抗病毒蛋白乐复能质控方法与质量标准的建立[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2009年04期

相关会议论文 前10条

1 刘麟;;应用新型生物质谱技术快速定量多肽毒素并解析分子结构[A];第九届中国生物毒素学术研讨会论文摘要[C];2009年

2 夏天瑶;白春杰;杨琳;张金岩;惠琦;;注射用胸腺肽热稳定性试验的检测[A];2006年全国生化与生物技术药物学术年会论文集[C];2006年

3 邱晓彦;张亮;李国辉;邓郁青;郝鹏;朱小辉;黄大无;;癌细胞内Ig基因的表达及Ig样蛋白的生物学活性探讨[A];第七届全国肿瘤生物治疗学术会议论文集[C];2001年

4 仲燕;刘军华;张建鹏;冯伟华;焦炳华;;东海贻贝抗菌肽基因的克隆表达及其生物学活性研究[A];中国海洋生化学术会议论文荟萃集[C];2005年

5 马慧香;徐锦堂;姜振友;张穗梅;赵松滨;陈建苏;;rhTGF-β1及TGF-β1基因转染对兔角膜内皮细胞生物学活性的影响[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年

6 付燕;林洋;王蕙;江国托;;嗜酸乳杆菌P_(302)所产类细菌素的生物学特性及菌株耐药性分析[A];首届中国兽药大会——兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集（2008）[C];2008年

7 陆长明;邓忠彬;郁建峰;马泓冰;王凤鸣;张学光;;人ICOS/GL50在大肠杆菌中表达及其生物学活性研究[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年

8 袁力勇;饶春明;王军志;;重组人纽兰格林体外生物学活性测定方法的研究[A];全面建设小康社会：中国科技工作者的历史责任——中国科协2003年学术年会论文集（上）[C];2003年

9 张瑜;马凤龙;王卓;郑洁;乔彦良;;牛乳素的研究进展[A];京津冀畜牧兽医科技创新交流会暨新思想、新观点、新方法论坛论文集[C];2008年

10 霍畅媛;刘宝山;何剑斌;;干扰素-Tau的生物活性及研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集（上册）[C];2009年

相关重要报纸文章 前10条

1 记者马艳红;重新氧化复性工艺提高rhIL-2收率[N];中国医药报;2005年

2 ;I型胶原蛋白的开发与应用技术[N];科技日报;2007年

3 于丽珊;从细胞因子网络角度认识“证”[N];中国中医药报;2006年

4 编译 Seven;一个新药30多年的发现历史与无与伦比的未来[N];医药经济报;2010年

5 东方证券 曹建明;干扰素（IFN）[N];中国经营报;2000年

6 东东;胰岛素当用则用[N];医药经济报;2003年

7 于丽萍;人到老年防缺铬[N];大众卫生报;2006年

8 谈春荣;成分输血好处多[N];健康报;2005年

9 李菲;EPO“黄金时代”来临[N];医药经济报;2006年

10 中南大学湘雅医院教授 罗学宏;长期用干扰素如何应对副作用？[N];大众卫生报;2008年

相关博士学位论文 前10条

1 刘孝菊;成纤维细胞生长因子23及其拮抗剂蛋白的基因克隆、表达与生物学活性研究[D];吉林大学;2012年

2 苏帅;重组马立克氏病毒及其突变株生物学活性的比较研究[D];山东农业大学;2013年

3 刘菲;天府肉鹅α干扰素基因克隆、表达及其生物学活性研究[D];四川农业大学;2011年

4 戴仪;重组人色素上皮衍生因子的制备及生物学活性研究[D];复旦大学;2010年

5 秦艺e，

本文编号：2136087