重组人可溶性BAFF及其突变体的制备与活性分析

发布时间：2018-07-23 08:38

【摘要】：TNF 家族的B 淋巴细胞活化因子(B cell activating factor belonging to the TNF family,BAFF)是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的一个新成员,它属Ⅱ型跨膜蛋白,通过与其受体结合而广泛参与B 细胞增殖分化及抗体的产生;同时也参与T 细胞的活化与应答过程,在体液免疫和细胞免疫中具有重要作用。研究证实BAFF 过表达密切参与了多种自身免疫性疾病和某些肿瘤的发生和发展。因此,BAFF 及其受体有望成为治疗相关性疾病时进行药物设计的新靶点。为此我们克隆了编码人BAFF 胞外区134-285氨基酸残基(即可溶性BAFF,sBAFF)及其突变体cDNA,构建了相应重组表达质粒,表达并纯化了sBAFF 及其突变体蛋白,最后对sBAFF 及其突变体蛋白的功能活性进行了鉴定。所取得的主要研究结果如下: 1.经RT-PCR 成功地克隆了sBAFF cDNA。测序后经查对,与GenBank 上登录的编码相应sBAFF cDNA 的序列完全一致。 2.以pUC19/sBAFF 为模板,经一步反向PCR 构建sBAFF 的突变体cDNA,使BAFF 217-224 位的八个氨基酸(VHVFGDEL)的编码序列被GG,SS,SG 和GS 的编码序列所取代。 3.将测序正确的野生型和突变体目的片段插入原核表达质粒pQE-80L,成功地构建了重组原核表达质粒pQE-80L/sBAFF,pQE-80L/GG,pQE-80L/SS,pQE-80L/SG 及pQE-80L/GS。 4.上述质粒分别转化大肠杆菌DH5α,经IPTG 诱导,均获得了较高水平的表达。SDS-PAGE 和Western blot 分析表明,重组sBAFF 蛋白主要位于包涵体中,分子量约为20kDa;而四个突变体蛋白则在包涵体和胞浆中均有表达,且在胞浆中表达占优势,分子量约为19kDa。确立了目的蛋白在大肠杆菌中高效表达的最佳诱导表达条件为终浓度0.5mmol/L 的IPTG 在37℃诱导表达4 小时。 5.sBAFF 蛋白经Ni2+-NTA 纯化系统及尿素分步透析,得到了有效纯化和复性,复性蛋白经Sephadex G75 柱分析显示,以单体和三聚体两种形式存在。四个突变体蛋白在天然状态下经Ni2+-NTA 纯化系统和PBS 透析后也得到了有效纯化。纯化蛋白在SDS-PAGE 上均呈现单一条带。
[Abstract]:TNF- family B cell activating factor belonging to the family (BAFF) is a new member of the tumor necrosis factor (TNF-) superfamily. It belongs to type 鈪，

本文编号：2138834