肺炎链球菌SpxB蛋白的细胞表达定位、保守性分析及其生物学功能初探

发布时间：2018-07-25 19:37

【摘要】：目的鉴定肺炎链球菌中spxB基因编码蛋白的丙酮酸氧化酶活性、细胞表达定位和保守性表达,并初步研究该基因对细菌毒力影响的部分机制。方法利用PCR方法扩增肺炎链球菌D39菌株的spxB基因全长序列,并将其整合至表达载体pET-28a(+),经测序鉴定后,将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达含有His标签的rSpxB蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,使用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,采用一种商品丙酮酸氧化酶活性质控方法鉴定其酶活性。以rSpxB蛋白免疫昆明小鼠获得其多克隆抗体。采用ELISA检测多克隆抗体效价,采用Western blot鉴定抗体的特异性和蛋白的保守性表达。采用流式细胞术鉴定spxB的细胞表达定位。构建spxB缺陷菌,通过与流感嗜血杆菌进行共同培养初步探索其毒力机制。结果实现了具有丙酮酸氧化酶活性SpxB蛋白的可溶性表达,该蛋白免疫小鼠后获得高效价特异的抗SpxB蛋白抗血清,Western blot鉴定显示SpxB蛋白在1、2、4、6B、14、19F和23F等血清型肺炎链球菌均有表达,流式细胞术检测显示SpxB蛋白的荧光信号较阴性对照有右移,但较阳性对照的荧光信号弱很多。野生菌株D39产生的过氧化氢显著高于spxB缺陷菌,D39菌株对流感嗜血杆菌的生长抑制作用显著强于spxB缺陷菌。结论肺炎链球菌spxB基因编码的蛋白具有丙酮酸氧化酶活性,在肺炎链球菌中有保守表达,且主要表达于细胞内。该蛋白有助于肺炎链球菌与流感嗜血杆菌共同生长时的优势生长。
[Abstract]:Objective to identify the pyruvate oxidase activity, cellular expression localization and conservative expression of the spxB gene encoding protein in Streptococcus pneumoniae, and to study the mechanism of the effect of the gene on bacterial virulence. Methods the full-length spxB gene of Streptococcus pneumoniae D39 was amplified by PCR. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) after being sequenced and integrated into the expression vector pET-28a (),. RSpxB protein with His tag was induced by IPTG. After purification by Ni-NTA affinity chromatography, SDS-PAGE was used to identify the purity of the protein, and a quality control method for the activity of pyruvate oxidase was used to identify its enzyme activity. Kunming mice were immunized with rSpxB protein to obtain their polyclonal antibodies. Polyclonal antibody titers were detected by ELISA and the specificity of antibody and conserved expression of protein were identified by Western blot. Cell expression localization of spxB was identified by flow cytometry. The virulence mechanism of spxB deficient bacteria was studied by co-culture with Haemophilus influenzae. Results the soluble expression of SpxB protein with pyruvate oxidase activity was achieved. After immunizing mice, a high titer specific anti SpxB protein antiserum was obtained. Western blot analysis showed that SpxB protein was expressed in serotypes of Streptococcus pneumoniae, such as 1, 2, 2, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, 4, Flow cytometry showed that the fluorescence signal of SpxB protein shifted to the right compared with the negative control, but much weaker than that of the positive control. The hydrogen peroxide production of wild strain D39 was significantly higher than that of spxB deficient strain D39, which inhibited the growth of Haemophilus influenzae significantly more than that of spxB deficient strain. Conclusion the protein encoded by spxB gene of Streptococcus pneumoniae has pyruvate oxidase activity, conserved expression in Streptococcus pneumoniae, and mainly expressed in cells. This protein contributes to the dominant growth of Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae.
【作者单位】： 重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学教育部重点实验室;
【基金】：重庆市自然科学基金(CSTC 2001BB5137)~~
【分类号】：R378.12

【共引文献】

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