Cullin-5蛋白单克隆抗体的制备

发布时间：2018-08-26 13:55

【摘要】： Cul5蛋白作为E3复合物的一个支架蛋白,全长为784个氨基酸。在体外表达Cul5全长蛋白比较困难,我们通过PCR的方法获得Cul5蛋白N末端138个氨基酸的表达基因,克隆至pRSETB表达载体中,进行融合表达,获得His-融合的Cul5蛋白,经Ni-NTA亲和纯化树脂纯化获得高纯度的Cul5可溶性蛋白,SDS-PAGE鉴定蛋白的分子量为18KD左右。以纯化的Cul5蛋白作为抗原免疫雌性Balb/c小鼠,小鼠经鉴定产生抗体后,取脾细胞与处在对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞在浓度为50%的聚乙烯二醇(PEG)的作用下融合,经HAT培养基选择性培养,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤,获得了4株特异性分泌抗Cul5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过初步纯化杂交瘤细胞上清,得到高效价的抗Cul5蛋白单克隆抗体。
[Abstract]:As a scaffold protein of E 3 complex, Cul5 protein is 784 amino acids. It is difficult to express the full-length Cul5 protein in vitro. We obtained 138 amino acid expression genes of the N-terminal of Cul5 protein by PCR method, cloned them into pRSETB expression vector, and obtained the His- fusion Cul5 protein. The high purity Cul5 soluble protein was purified by Ni-NTA affinity purification resin. The molecular weight of the protein was identified as 18KD by SDS-PAGE. The purified Cul5 protein was used as antigen to immunize female Balb/c mice. The spleen cells and SP2/0 myeloma cells in logarithmic growth phase were fused with 50% polyvinylenediol (PEG). Four hybridoma cells secreting monoclonal antibodies to Cul5 protein were obtained by selective culture on HAT medium and indirect ELISA method. A high titer monoclonal antibody against Cul5 protein was obtained by purifying the supernatant of hybridoma cells.
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

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本文编号：2205071