抗人类肺动脉内皮细胞自身抗体的检出及肺血管内皮损伤机制的研究

发布时间：2018-10-11 13:47

【摘要】： 实验目的系统性结缔组织病(connective tissue disease，，CTD)如系统性硬化症(systemic sclerosis，SSc)、混合结缔组织病(mixed connective tissue disease，MCTD)、多发性肌炎(polymyositis，PM)以及系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)等常伴发肺血管病变，部分可最终导致肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)。合并PAH的CTD患者预后极差，以SLE、SSc及PM混合出现为特点的MCTD患者中，几近半数死因要归于PAH。然而，系统性CTD患者发生肺血管损伤的相关机制目前尚不十分清楚。小核核糖体蛋白(small nuclear ribonucleoproteins，snRNPs)是一组由小RNA及其相连多肽组成的核糖体蛋白颗粒，弥漫散在地分布于细胞核质内，主要参与前mRNA的剪切过程。CTD患者血清中常可检出抗snRNPs自身抗体。snRNPs包括多种抗原如U1、U2、U5、U4／U6等，其中含量最丰富的是U1RNP。绝大多数snRNPs都包含一种SmRNP核心结构，通过免疫沉降法可沉淀出所有含Sm核心结构的RNP抗原。抗U1RNP抗体阳性是MCTD的诊断依据之一，MCTD患者血清抗U1RNP抗体滴度明显升高。抗U1RNP抗体阳性的MCTD患者PAH的发生率较高，PAH是抗U1RNP抗体阳性患者预后不良的重要危险因素。研究表明，抗U1RNP抗体可上调人类肺动脉内皮细胞(human pulmonary artery endothelial cell，HPAEC)表达细胞间粘附分子-1(intercellular cell adhension molecule-1，ICAM-1)、内皮细胞白细胞粘附分子-1(endothelial leucocyte adhesion molecule-1，ELAM-1)以及MHCⅡ类分子，通过免疫反应参与肺动脉血管病变的形成。抗U1RNP抗体介导的免疫反应，可最终导致CTD患者出现PAH。抗U1RNP抗体与CTD患者的PAH的形成有关，但不是唯一因素。研究显示，除外抗U1RNP抗体，其它抗原特异性自身抗体如抗内皮细胞抗体(anti-endothelial cell antibody，AECA)在PAH的发生、发展过程中也发挥一定作用。临床上大多数MCTD患者并不合并PAH，反之，许多合并PAH的CTD患者的血清中亦不存在抗U1RNP抗体。近年来研究发现，在系统性自身免疫疾病患者的血清中常可检出AECA，并显示AECA与动脉血管内皮损伤有关。因此，我们推测CTD患者外周血中，存在特异性抗HPAEC自身抗体，它们不同于抗RNP抗体等抗核抗体，可特异性地与HPAEC抗原结合，通过自身免疫性炎症反应参与肺动脉血管损伤及PAH形成。这种特定部位抗原抗体反应所致的肺动脉血管内皮炎症可能是CTD患者发生PAH的机制之一。AECA同HPAEC抗原表位结合后，可能作为刺激信号改变HPAEC的功能状态。有资料证实，AECA可上调内皮细胞E-选择素、ICAM-1及VCAM-1的表达，诱导内皮细胞分泌白介素-1β(imerleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)和白介素-8(interleukin-6，IL-8)；还可活化血管内皮细胞，产生白细胞趋化因子如RANTES(Regulated Upon Activation，Normal T-cell Expressed and Secreted，活化T细胞调节的正常T细胞表达和分泌的因子)及淋巴细胞活化共刺激分子。RANTES是单核细胞及T细胞的重要趋化因子，具有控制单核细胞和淋巴细胞定向迁移的免疫学特性，通过促进白细胞募集、粘附以及内皮细胞活化诱发炎症反应，造成血管内皮损伤。PAH患者肺组织原位杂交及免疫组化分析发现，内皮细胞是RANTES的主要来源，PAH患者肺组织中RANTES mRNA水平明显升高。另外，RANTES通过间接诱导内皮细胞转换酶-1和内皮素-1的产生，促进PAH形成。目前，关于MCTD患者PAH发病机理的研究逐渐增多，但自身抗体介导的肺动脉血管损伤机制以及HPAEC本身在血管损伤过程中的作用仍不清楚。我们推测，抗HPAEC自身抗体在系统性自身免疫疾病患者PAH发生中起一定作用，HPAEC本身可能也参与血管炎的发生。临床抗U1RNP抗体阳性患者肺损伤多见，且有研究显示抗U1RNP抗体与肺血管内皮损伤相关，本研究选择抗U1RNP抗体阳性血清作为研究对象，检测血清特异性抗HPAEC抗体，探讨该抗体同抗U1RNP抗体之间的关联性，并观察其对HPAEC分泌RANTES的影响，在此基础上分析抗HPAEC抗体在肺动脉血管免疫损伤中的作用，以期阐明CTD患者PAH的发病机制，为更有效临床治疗药物的研制开发提供新的理论和实验依据。实验方法一、RNA-免疫沉降法(RNA-IPP)筛选抗U1RNP抗体阳性血清 2mg sepharose CL-4B蛋白A与500μl IPP缓冲液均匀混合后，加入10μl患者血清，4℃翻转混合2h。血清抗体包被的cepharose颗粒用500μl IPP缓冲液冲洗3次后与细胞抗原反应，抗原用Hela细胞制备(每个标本6×10~6个细胞)。HeLa细胞加入0.3ml NET-2缓冲液中，经超声裂解后，收集细胞裂解液上清，加入400μl NET-2缓冲液，其中含有抗体包被的cephalose颗粒，4℃孵育2h。反应后的颗粒，经NET-2缓冲液洗涤3次并离心后，加入270μl NET-2缓冲液，30μl 3M醋酸钠溶液，15μl 20％SDS溶液，其中RNA经phenol／chloroform／isoamyl alcohol(50：50：1)提取后用3倍体积的乙醇沉淀析出后，经10％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶电泳分离，最后通过银染色显影。二、蛋白质免疫印记杂交检测血清特异性抗HPAEC抗体 (一)细胞抗原的制备 HPAEC购自日本KURABO公司，经血管内皮细胞专用培养基(HuMedia-EG2)培养。使用前细胞用Trypsin／EDTA溶液自细胞培养瓶分离，中和液中和，PBS洗涤3次。HPAEC经细胞裂解液(10mM Tris-Hcl，150mM NaCl，lmM EDTA，1mM EGTA，1％Nonidet P-40，0.2％SDS，10mM NaF，2mM Na_2VO_4)裂解。裂解后的细胞液与等量的SDS样品缓冲液混合后保存，调整细胞浓度至2000个／μl。同时制备HeLa细胞作为对照。细胞裂解液使用前于-80℃保存。 (二)蛋白质免疫印记杂交裂解细胞液煮沸后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至硝酸纤维素膜(NC膜)后与血清孵育。同一份血清同时与HPAEC和HeLa反应，每个电泳槽20μl裂解细胞液。NC膜用含5％脱脂奶粉的PBS封闭，于4℃过夜。用PBS-NP40(含有0.05％NP40的PBS)洗涤3次后，NC膜同患者血清(以PBS做1：100稀释)于室温反应3h。PBS-NP40洗涤3次后，NC膜于羊抗人IgG(H+L)的PBS(1：7500，Promega，Corp．USA)中孵育2h。再次用PBS-NP40洗涤3次，NC膜上结合的IgG蛋白经BCIP／NBT显影观察。以上所有的孵育反应过程均在封闭的聚乙烯透明袋中进行。三、抗-HPAEC特异性抗体洗脱印记杂交为分析抗HPAEC抗体同其它自身抗体的结构相关性，NC膜上同HPAEC抗原结合的自身抗体，用ImmunoPure IgG洗脱缓冲液(PIERCE，USA)洗脱。含有目的抗体的NC膜，置于3ml洗脱缓冲液中，震荡5min后，收集洗脱液。另取3ml洗脱缓冲液，重复上述过程一次。于最后收集的6ml洗脱液中加入800μl 1M Tris-HCl(PH 7.5)，调整pH值至7.0。血清IgG抗体洗脱液，进一步同HPAEC和HeLa细胞抗原杂交反应。四、流式细胞分析术检测细胞表面抗原 (一)细胞的收集用0.01％EDTA／PBS(含钙离子)10-20ml冲洗细胞培养瓶，适当用力拍打，使附壁生长的HPAEC从内壁解离。重复两次，收集所有细胞悬液，至计数后平均每个样品细胞数2～4×10~4个。HeLa细胞则直接取出同样数量细胞的细胞悬液。用2％FCS／PBS液洗涤两次后，离心，各留取约2ml的细胞悬液。 (二)细胞样品荧光抗体染色每一个染色管中加入200μl的细胞悬液后，加入2μl血清。混匀后4℃避光反应1h。每管加入2％FCS／PBS溶液2ml，低温离心(2000rpm，5min)，洗涤两次，弃上清。待检样品用1μl anti-Human IgG-FITC标记染色，另设阴性对照管及阳性对照管，阴性对照不加荧光抗体，阳性对照加入anti-Human CD54 IgG-Biotin及Avidin-FITC各1μl，混匀后4℃避光反应1h。用2％FCS／PBS洗涤两次后，弃上清，静置15min后，上机。 (三)流式细胞仪检测调定参数后，通过流式细胞仪，利用FACS CELLQUEST软件获取细胞，每个样品分析15，000个细胞，以阴性对照为参考，对所检测标本进行定性分析，阳性对照管所在区域设为阳性分析结果。五、分离纯化血清IgG抗体患者血清IgG抗体应用ImmunoPure IgG(PIERCE，USA)纯化分析试剂盒分离纯化。血清用结合缓冲液1：1稀释后，10，000rpm离心20min。取上清加至蛋白AIgG亲和分离柱中。样品与蛋白A琼脂糖凝胶充分作用后，用15ml结合缓冲液冲洗。结合的IgG用5ml洗脱缓冲液洗脱，洗脱液用500μl结合缓冲液中和。通过酶标仪280nm测定IgG浓度。六、ELISA方法测定细胞培养上清RANTES浓度分离出的IgG抗体加至HPAEC的培养液中，调整IgG的终浓度至1mg／dl。孵育48h后，收集培养上清。用ELISA(RD SYSTEMS，USA)试剂盒检测上清中RANTES含量。通过酶标仪于540nm波长读取OD值，用SoftMax Pro 4.3.1 LS软件分析数据，绘制标准曲线，计算RANTES含量(pg／ml)。实验结果一、RNA-IPP筛选血清通过RNA-IPP分析法，选出抗U1RNP抗体阳性血清64例。其中SLE 31例，MCTD14例，SSc 3例，类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)2例，干燥综合征2例，PM、未分化CTD及皮肤型红斑狼疮患者各1例，另有9例患者的诊断尚不十分明确。64例中有4例合并PAH。二、免疫杂交分析检测抗HPAEC自身抗体通过RNA-IPP筛选的64例抗U1RNP抗体阳性血清标本中，其中有37例含有一种针对HPAEC31kDa抗原(HPA31)的抗体。37例抗HPA31抗体阳性标本中有14例可同时检测到与HPAEC 90kDa抗原(HPA90)反应的自身抗体。两种抗HPAEC抗体出现的阳性率分别为57.8％(37／64)和21.9％(14／64)。抗HPA31抗体在HeLa细胞抗原检出阳性率仅为9.4％(6／64)，而在抗HPA31抗体阴性的血清和以HeLa细胞为抗原的反应中，抗HPA90抗体均未检出。提示HPA31和HPA90抗原主要在HPAEC上表达，抗U1RNP抗体阳性患者血清中存在特异性抗HPAEC的自身抗体。抗HPA31抗体和抗HPA90抗体，在4例合并PAH患者血清有3例出现阳性，2例抗U1RNP抗体阴性合并PAH者及健康志愿者血清中两种抗体均阴性。另外，与HeLa细胞抗原反应时，37例抗HPA31抗体阳性的标本中有33例，同时检测出抗32kDa及30kDa抗原的自身抗体(抗32／30kDa抗体)，出现的比率为89％。提示HeLa细胞的32／30kDa蛋白同HPAEC的31kDa蛋白、或者它们的抗体之间可能存在某种关联。三、抗HPA31抗体同抗U1、U2、SmRNP抗体及抗U1RNP-B’／B、A、70K抗体相关性分析 RNA-IPP分析发现，64份抗U1RNP抗体阳性血清，其中37例抗HPA31抗体阳性，而抗U1RNP抗体阴性血清则未检出抗HPA31抗体。抗U1RNP抗HPA31抗体的检出与抗U1RNP抗体存在显著的相关性。抗HPA31抗体阳性血清中，抗U2RNP抗体及抗Sm抗体阳性者分别为11份和7份，仅占30％及19％。同抗HPA31抗体阴性组相比，均无显著性差异。免疫印迹杂交结果显示，抗HPA90抗体仅见于抗HPA31抗体阳性血清标本，在抗HPA31抗体阴性标本中则未检出，抗HPA90抗体与抗HPA31抗体具有显著相关性(P＜0.001)。抗HPA31抗体阳性37例中有27例抗U1RNP-B’／B抗体阳性，占73％，而抗HPA31抗体阴性27例中仅有6例阳性，占22.2％(x~2=16.097，P＜0.005)。抗HPA31抗体的出现同抗U1RNP-B’／B抗体有相关性。抗HPA31抗体阳性的血清，抗U1RNP-A和抗U1RNP-70K的自身抗体的检出率分别为67.6％(25／37)以及37.8％(14／37)，其中抗U1RNP-A抗体在抗HPA31抗体阳性组出现的比率明显高十抗HPA31抗体阴性组(x~2=7.346，P＜0.01)。在抗-U1RNP抗体阴性及健康对照者的血清中，抗U1RNP-B’／B，A及70K抗体均阴性。抗HPA31抗体的检出与抗U1RNP-B’／B抗体及抗U1RNP-A抗体有关联。四、抗HPAEC抗体洗脱印记分析抗HPA31抗体和抗HPA90抗体洗脱液，分别同HPAEC及HeLa细胞抗原行免疫印记杂交分析。结果显示，抗HPA31抗体不仅同HPA31抗原反应，同时识别HPA90抗原。但抗HPA31抗体不能识别U1RNP-B’／B、A及70K抗原，也不能同HeLa细胞上的任何抗原(包括30kDa及32kDa抗原)反应。表明抗HPA31抗体同抗U1RNP-B’／B、A和70K抗体以及同HeLa细胞30kDa及32kDa抗原的抗体无交叉反应；抗HPA90抗体经洗脱杂交反应后发现，它可以和HPA31抗原以及HeLa细胞的50kDa，32kDa和30kDa抗原发生反应。以上结果说明抗HPA90抗体与抗HPA31抗体之间有交叉反应性，并且提示HPA90与HeLa细胞50kDa，32kDa和30kDa的抗原及相应抗体之间存在关联。五、流式细胞分析检测HPAEC表面抗原 6份抗HPAEC阳性血清中有4份可以检测到与HPAEC表面抗原反应的抗体，而所有抗HPAEC阴性的血清中均未检出。HeLa细胞表面与血清抗体结合的表面抗原均为阴性。提示与HPAEC特异性抗体反应的抗原存在于细胞的表面，且主要在HPAEC上表达。六、抗HPA31抗体对HPAEC分泌RANTES的影响抗HPA31抗体阳性血清纯化分离的IgG抗体加入HPAEC的培养上清，共同孵育后，上清中RANTES的平均浓度为23.1pg／ml，而抗HPA31抗体阴性者，RANTES的平均浓度仅为13.1pg／ml。两者间差异显著(t=2.197，P＜0.05)。提示，抗HPA31抗体对HPAEC分泌RANTES有促进作用。结论 1、CTD患者血清中存在与HPAEC反应的特异性IgG抗体，该抗体可识别HPAEC分子量为31kDa(HPA31)和90kDa(HPA90)的抗原。 2、抗HPA31抗体的检出同抗U1RNP抗体、抗U1RNP-B’／B抗体、抗U1RNP-A抗体有关联，而与抗U1RNP-70K、抗U2RNP抗体、抗SmRNP抗体不相关。 3、抗HPA31抗体同抗HPA90抗体具有交叉反应性，但两者均不能识别U1RNP-B’／B、U1RNP-A及U1RNP-70K抗原。抗HPAEC抗体同抗U1RNP抗体结构上无关联。 4、HPA31抗原和HPA90抗原位于HPAEC的表面。 5、抗HPAEC抗体可通过与细胞表面的抗原结合，促进HPAEC分泌RANTES。 6、RANTES的产生和分泌增多可能是抗HPAEC抗体诱导肺血管内皮损伤的机制之一。
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【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【参考文献】