肺炎链球菌CbpA基因疫苗的构建及与蛋白质疫苗联合免疫效果的实验研究

发布时间：2019-07-17 07:52

【摘要】： 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)是全世界范围内引起感染和死亡的主要病原菌之一,是引起社区获得性肺炎、中耳炎和脑膜炎最常见的病原菌。随着细菌耐药株的不断发现,疫苗在其感染防治中的作用越来越重要。目前主要所用的是23价肺炎多糖疫苗和7价结合疫苗,但前者覆盖的血清型有限而且不是T细胞依赖性的,对免疫系统发育不完善的2岁以下小孩和老年人的保护性弱;后者存在荚膜血清型转换和载体携带的荚膜多糖血清型数量有限以及生产成本很高,不适合在发展中国家大量使用,并且在肺炎高发人群中的保护作用小等问题。近年来,DNA疫苗由于能够诱导出较好的体液免疫和细胞免疫而日益收到重视,被誉为疫苗的第三次革命。 S.pn胆碱结合蛋白A(choline binding protein A,CbpA)是S.pn主要的毒力因子之一,在肺炎链球菌侵袭性感染中起着重要的作用。它能与多聚免疫球蛋白受体( polymeric immunoglobulin receptor,pIgR)特异性结合, S.pn通过CbpA与pIgR结合粘附到内皮细胞后,才能侵袭粘膜屏障。CbpA既是S.pn的黏附素,又是S.pn的侵袭蛋白,CbpA分子C-末端与S.pn表面TA或LTA的胆碱结合,同时N-末端连接宿主细胞的复合糖,起到了连接细菌和宿主细胞的桥梁作用;同时CbpA是S.pn引起脑膜炎最关键的毒力因子。 目的:本研究拟构建肺炎链球菌毒力因子CbpA DNA疫苗,将构建好的DNA疫苗直接肌肉注射给小鼠,观察其在小鼠体内诱导的体液免疫应答及保护效率;再将DNA疫苗与重组亚单位疫苗联合接种给小鼠,观察其在小鼠体内诱导的体液免疫应答及保护效率。 方法:用PCR和基因克隆技术构建真核表达质粒pcDNA3.1/CbpA,再将构建好的重组质粒体外转染COS-7细胞,用Western blot鉴定目的基因的表达,然后进行动物实验:用质粒pcDNA3.1/CbpA、CbpA重组蛋白质,质粒pcDNA3.1/CbpA+IL-2、质粒pcDNA3.1/CbpA+CbpA重组蛋白质分别免疫小鼠,免疫3次后,ELISA方法检测小鼠血清中特异性抗体水平,14天后,每只小鼠经腹腔感染TIGR4型肺炎链球菌,连续监测21天小鼠的生存时间,计算各组的生存率。 结果:①酶切鉴定和基因测序结果显示,S.pn CbpA基因片段被正确克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中。CbpA基因片段的核苷酸序列长度为1461bp,与GeneBank中序列比较,无碱基突变。②将构建好的重组质粒体外转染COS-7细胞,Western blot成功鉴定出目的基因CbpA的表达。③动物实验结果发现,所有的实验组(除对照组外)小鼠血清中都检测到了特异性抗体,其中以50ug pcDNA3.1/CbpA+50ug CbpA重组蛋白组小鼠血清中特异性抗体水平最高。④免疫攻毒保护实验发现: 50ug pcDNA3.1/CbpA +50ug CbpA重组蛋白联合免疫组、50ug pcDNA3.1/CbpA +10ug CbpA重组蛋白联合免疫组、pcDNA3.1/CbpA+IL-2组的21天存活率与对照组的差异有显著性(P0.05)。其中50ugpcDNA3.1/CbpA+50ug CbpA重组蛋白联合免疫组取得了100%存活率。 结论:①成功构建和表达了pcDNA3.1/CbpA真核表达质粒,动物实验结果表明该DNA疫苗具有一定的免疫原性和保护性,细胞因子IL-2能增强CbpA DNA疫苗的免疫原性和保护效率。②CbpA DNA疫苗和CbpA蛋白质疫苗联合免疫可诱导小鼠产生比单独应用DNA疫苗或蛋白质疫苗较高的特异性抗体水平,CbpA蛋白质疫苗联合免疫可提高DNA疫苗的保护效率。DNA疫苗和蛋白质疫苗联合免疫是一种有价值的免疫方法。
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图片说明： 30图 1 PCR 扩增 cbpA 基因片断Fig.1 PCR products for CbpALane M: DNA markerLane 1: Target gene of CbpALane 2: ORF of CbpA及 PCR 鉴定A3.1(+)连接后组成了重组质粒 pc片段（1461bp）（图表 3）。
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图片说明： 图 2 重组 pcDNA3.1/cbpA 的双酶切鉴定Fig.2 Identification of the recombinant pcDNM: DNA marker;Lane 1: pcDNA3.1/cbpA digested by EcoRI anLane 2: pcDNA3.1/cbpA digested by EcoRI anDNA-cbpA 双向测序结果A-cbpA 测序结果与 GenBank 报道序列完全TGGTACCGAGCTCGGATCCATTATGGACATGCGACAGAGAACGAGGGAGCTACCCAAATGAAAGTCAGGCAGAACAAGGAAACGAGATAAGGCAAGGAAAGAGGTC
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【共引文献】

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本文编号：2515347