猪苓多糖协同卡介苗诱导小鼠免疫应答启动机制的研究

发布时间：2019-07-17 10:56

【摘要】： 【目的】：1．研究猪苓多糖(polyporus polysaccharide，PPS)协同卡介苗(bacillus calmette guerin，BCG)诱导小鼠腹腔巨噬细胞TLR2、TLR4、CD14、黏附分子及共刺激分子的表达，核转录因子NF-κB的激活，炎症因子的表达，探讨其诱导的免疫应答启动机制。2．研究卡介苗在人膀胱癌细胞株T24中的直接作用部位和对T24超微结构的影响，及猪苓多糖对其的协同作用。 【方法】：1．实验分组，每组18只NIH小鼠(26-28g)：①对照组(皮下注射生理盐水0.1ml／只)②BCG组(皮下注射BCG悬液1mg／只)③B+P组(BCG给药同前，同时腹腔注射PPS 2mg／只，)④PPS组(腹腔注射PPS 2mg／只)。分别在给药后2小时，12小时，24小时从每组各抽取6只小鼠，处死后收集小鼠腹腔巨噬细胞。 2．应用流式细胞术观察PPS、BCG刺激后小鼠腹腔巨噬细胞TLR2，TLR4，CD14，CD11b，CD40的表达情况。3．用间接荧光法对PPS、BCG免疫后的小鼠腹腔巨噬细胞进行染色，利用激光共聚焦显微镜技术，观察核转录因子NF-κB分子，在胞浆和胞核表达的变化以及其转移的情况。4．运用ELISA技术，检测PPS、BCG免疫后的小鼠腹腔巨噬细胞上清液中IL-1β、IL-12和IL-10，脾脏匀浆液中IL-2和IL-4及外周血清TNF-α的含量。5．用透射电镜和扫描电镜技术观察BCG在T24中的作用部位，对T24超微结构的影响，及PPS的协同作用。6．实验数据使用PEMS 3.0统计分析软件分别进行多个均数比较分析。 【结果】：1．PPS协同BCG体内刺激对小鼠腹腔巨噬细胞TLRs表达的影响：(1)PPS组12h巨噬细胞TLR2表达高于对照组(P＜0.05)，24h后下降。B+P组2h后TLR2表达高于PPS和BCG单用组(P＜0.05)，12h之后下降。(2)PPS组小鼠巨噬细胞TLR4表达在3个时点无明显变化，在12h、24h低于对照组(P＜0.05)。B+P组2h后TLR4表达高于PPS和BCG单用组(P＜0.05)。(3)PPS组小鼠巨噬细胞CD14表达在3个时点无明显变化，在12h、24h低于对照组(P＜0.05)。B+P组2h后CD14表达高于PPS和BCG单用组(P＜0.05)，之后下降。 2．PPS协同BCG体内刺激对小鼠腹腔巨噬细胞共刺激分子表达的影响：(1)PPS组12h小鼠巨噬细胞CD11b表达高于对照组(P＜0.05)，24h后下降。B+P组2h和12h CD11b表达高于PPS和BCG单用组(P＜0.05)，之后下降。 (2) PPS组小鼠巨噬细胞CD40表达在3个时点无明显变化，在2h、12h低于对照组(P＜0.05)。B+P组2h后CD40表达高于PPS(P＜0.05)。 3．PPS协同BCG体内刺激对小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB活化的影响：(1)PPS组NF-κB胞核荧光强度在3个时点内缓慢上升，但均低于对照组(P＜0.05)；B+P组NF-κB胞核荧光强度高于PPS组(P＜0.05)，在12h明显增强，，与对照组相比差异有统计学意义。(2)PPS组NF-κB胞浆荧光强度在3个时点呈上升趋势，但均低于对照组(P＜0.05)；B+P组NF-κB胞浆荧光强度在2b和12h高于PPS组(P＜0.05)，在12h明显增强。(3)PPS组NF-κB核浆荧光强度比在3个时点呈下降趋势，24h低于对照(P＜0.05)；B+P组NF-κB核浆荧光强度比在24h明显上升，高于PPS组和对照组(P＜0.05)。 4．PPS协同BCG体内刺激对小鼠腹腔巨噬细胞细胞因子分泌的影响：(1)PPS组2h小鼠腹腔巨噬细胞IL-1β分泌高于对照组(P＜0.05)，B+P组IL-1β分泌低于PPS组，在2h和24h有统计意义(P＜0.05)。(2)PPS组小鼠脾匀浆上清中IL-4含量在3个时点变化不明显，低于对照组，但无统计意义。B+P组IL-4含量与PPS组相近，差异无统计意义。(3)小鼠腹腔巨噬细胞上清中未检测到IL-12，IL-10和脾匀浆液中的IL-2，外周血清的TNF-α。 5．BCG对T24的直接作用及形态学观察：BCG组2h细胞表面球状颗粒增多，胞膜不光整，BCG与癌细胞作用24小时，细胞表面微绒毛减少，有的肿胀，长突起大部分消失，小球状结构增多。与PPS联合组细胞表面出现较多粗的突起物。BCG被吞入胞浆或胞核，线粒体肿胀，胞浆胞核物质丢失，细胞呈溶解趋势。 综上所述：1．PPS体内单独刺激不能促进TLR分子的表达，联合BCG可产生协同作用并促进TLR分子和CD14的表达。2．PPS协同BCG可以促进黏附分子CD11b分子的表达。3．PPS协同BCG作用24h促使NF-κBp65向核内转移。4．PPS、BCG作用初期(24h)尚不能显著诱导炎症因子的释放。5．BCG对膀胱癌细胞有直接损伤作用，PPS有协同作用。 【结论】：猪苓多糖协同卡介苗作用初期能促进巨噬细胞表面CD14、TLR2和TLR4分子，及黏附分子CD11b表达增加，激活NF-κBp65，TLR分子及信号通路可能作为主要途径之一介导PPS和BCG启动机体免疫进而引发抗肿瘤效应。另外，BCG还可以通过直接损伤肿瘤细胞，释放出致炎物，参与免疫启动过程。
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图片说明： 1.即S组N卜KB胞核荧光强度在3个时点内缓慢上升，但均低于对照组(尸<0.05);B+P组N户K日胞核荧光强度高于PPS组(尸<0.05)，在12h明显增强，与对照组相比差异有统计学意义。(见表2一1，图2一1)2.即S组N卜KB胞浆荧光强度在3个时点呈上升趋势，但均低于对照组(尸<0.05);B+P组NF一KB胞核荧光强度在Zh和12h高于PPS组(P<0.05)，在12h明显增强。(见表2一2，图2一2)3.PPS组NF一KB核浆荧光强度比在3个时点呈下降趋势，24h低于对照(尸<0.05);B+P组NF一KB核浆荧光强度比在24h明显上升，高于PPS组和对照组(尸<0.05)。(见表2一3，图2一3)表2一 1NF一KB在胞核内的表达(万士s，n=6)grollPdose(mg/只)胞核荧光强度(Fn) Zh12h24heontrol 114.88士 19.43119.86士32.8 71.58士11.06*59.72士11.77*99.73士19.59今147.9士25.26*令65.42士1.87*74.77士9.17*138.73士43.55 0.1 0.1/0.2 0.210113961士 11.86*87士10.91今85.76士10.84*匕六PQ口七门DI+ BBpi*只 0.05vseontrol
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图片说明： 1.即S组N卜KB胞核荧光强度在3个时点内缓慢上升，但均低于对照组(尸<0.05);B+P组N户K日胞核荧光强度高于PPS组(尸<0.05)，在12h明显增强，与对照组相比差异有统计学意义。(见表2一1，图2一1)2.即S组N卜KB胞浆荧光强度在3个时点呈上升趋势，但均低于对照组(尸<0.05);B+P组NF一KB胞核荧光强度在Zh和12h高于PPS组(P<0.05)，在12h明显增强。(见表2一2，图2一2)3.PPS组NF一KB核浆荧光强度比在3个时点呈下降趋势，24h低于对照(尸<0.05);B+P组NF一KB核浆荧光强度比在24h明显上升，高于PPS组和对照组(尸<0.05)。(见表2一3，图2一3)表2一 1NF一KB在胞核内的表达(万士s，n=6)grollPdose(mg/只)胞核荧光强度(Fn) Zh12h24heontrol 114.88士 19.43119.86士32.8 71.58士11.06*59.72士11.77*99.73士19.59今147.9士25.26*令65.42士1.87*74.77士9.17*138.73士43.55 0.1 0.1/0.2 0.210113961士 11.86*87士10.91今85.76士10.84*匕六PQ口七门DI+ BBpi*只 0.05vseontrol
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【参考文献】

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本文编号：2515439