TLR联合激活的DC瘤苗的抗肿瘤作用及其相关机制研究

发布时间：2019-07-22 11:29

【摘要】： Toll样受体(toll-like receptor，TLRs)是一类主要表达在树突状细胞(dendritic cells，DC)、巨噬细胞等抗原提呈细胞(antigen-presenting cells，APC)上的跨膜蛋白，其识别病原体来源的产物，如TLR4识别革兰阴性菌的LPS；TLR3识别病毒感染时产生的双链RNA，而TLR9识别原核染色体和DNA病毒中的未甲基化CpG DNA基序等。TLRs在宿主免疫系统对病原体的抵御过程中起着关键性的作用，可以说TLRs控制着APC对适应性免疫应答的激活。DC是体内功能最强的APC，也是唯一能活化初始T细胞(na(?)ve T cell)的APC，在特异性激活初始T细胞、联结天然免疫和获得性免疫应答中发挥独一无二的作用。DC的成熟在免疫应答中具有重要意义，是激活T细胞、启动免疫应答的必要条件。表达在DC上的TLRs能识别各种不同的微生物或病毒，与相应配体结合后能引起IL-6、IL-12等前炎症因子的分泌、共刺激分子的上调为特征的DC活化。TLRs介导的信号转导途径分为MyD88依赖途径和MyD88非依赖途径。当前的TLR信号模型学说认为MyD88是TLR2、5、7、8、9转导信号的唯一接头分子，而TLR3依赖TRIF-IRF3介导的途径在识别病原后产生IFN-β。TLR4的信号转导至少通过两条途径，其中，MyD88依赖途径是TLR4介导细胞因子分泌所必需的，而另外一条MyD88非依赖途径是它介导上调表达共刺激分子和MHC分子所必需的。近来研究发现不同TLRs的联合可以产生更为迅速持久的DC活化，并且倾向于诱导Th1型反应，而诱导机体产生抗原特异性的Th1型免疫应答是抗肿瘤免疫和抗感染免疫的关键点之一。此外，越来越多的研究认为TLRs和调节性T细胞有密切关联，后者能抑制DC成熟、T细胞分化和IL-2分泌，是启动适应性免疫应答的又一调控点，而在肿瘤部位的调节性T细胞也是肿瘤细胞逃避机体免疫攻击的机制之一。TLR配体介导的信号可以扭转调节性T细胞的抑制作用。因此，本实验以TLR配体(LPS、Poly I：C或CpG-ODN)单独或联合激活DC瘤苗，观察TLRs联合刺激对DC表型、功能等的影响，进而在体内用EG7肿瘤模型研究该种经TLR配体单独或协同刺激的DC瘤苗对肿瘤的抑制作用及其相关免疫学机制。 目的 观察用TLRs联合激活的DC瘤苗对C57BL/6小鼠EG7(用OVA转染的EL4)肿瘤模型的抑制作用并探讨其可能的机制，为抗肿瘤治疗新方法提供实验依据。 方法 1．在体外用TLR配体单独或联合刺激DC：取6-8周龄C57BL/6小鼠，无菌分离股骨、胫骨，冲洗骨髓。将收集到的骨髓细胞破去红细胞后用DC培养基(mGM-CSF 10ng/ml，mIL-41ng/ml的完全培养基)孵箱培养，在培养的第2天小心弃去非黏附或疏松结合细胞，在培养的第6天用OVA刺激后分别用LPS、PolyI：C、CpG-ODN、LPS+PolyI：C、PolyI：C+CpG-ODN刺激，24h后收集细胞，得DC_(OVA)LPS、DC_(OVA)PolyI：C、DC_(OVA)CpG-ODN、DC_(OVA)(LPS+PolyI：C)、DC_(OVA)(PolyI：C+CpG-ODN)，然后检测各组DC表面CD40、CD80、CD86和MHCⅡ类分子(Ia~b)的表达，细胞上清中IL-6、IL-12p70、IL-23、INF-β的分泌水平以及各组DC刺激T细胞增殖能力的大小。 2．建立EG7肿瘤模型：C57BL/6小鼠品系，每组8只，共设7个组，分别为DC_(OVA)LPS组、DC_(OVA)PolyI：C组、DC_(OVA)CpG-ODN组、DC_(OVA)(LPS+PolyI：C)组、DC_(OVA)(PolyI：C+CpG-ODN)组和DC_(OVA)组，PBS为阴性对照组。各组中小鼠均右大腿外侧皮下接种EG7细胞，1×10~6cells/50μl/只。 3．用OVA作为抗原，观察各组DC瘤苗对EG7肿瘤的抑制作用：在肿瘤接种后第7天，用前面制备的DC瘤苗双侧腹股沟皮下注射(s．c．)治疗各组荷瘤小鼠，1×10~6cells/100μl/只，每侧注射50μl。末次治疗后第7天，随机取各组荷瘤小鼠脾细胞检测CD4~+CD25~+调节性T细胞比率并诱导细胞因子和CTL。然后用LDH释放法检测NK、CTL杀伤活性，，用ELISA试剂盒检测Th1/Th2细胞因子并观察记录肿瘤生长情况以及各组小鼠存活期。 4．数据分析：数据用SPSS软件处理，二次方差分析，当P＜0.01时认为有统计学意义。 结果 1．用TLR配体联合激活的DC无论在表型还是功能上都比单一配体刺激的DC具有更高的成熟度(P＜0.01)：TLRs联合尤其是TLR3和TLR9的联合在活化DC时在细胞因子(如IL-12p70、IL-23、IFN-β、IL-6)的分泌、共刺激分子(如CD40、CD80、CD86分子)和MHCⅡ类分子的表达以及刺激同种异体T细胞的增殖等方面都存在显著的协同效应。 2．在小鼠EG7肿瘤模型中，用TLRs联合激活的DC瘤苗进行腹股沟皮下注射治疗，显著抑制了肿瘤的生长，且存活时间明显延长：用TLR配体联合激活的DC瘤苗治疗后的DC_(OVA)(LPS+PolyI：C)组和DC_(OVA)(PolyI：C+CpG-ODN)组荷瘤小鼠的肿瘤显著小于单独刺激治疗组或DC_(OVA)组或PBS对照组(与单独刺激治疗组或DC_(OVA)组或PBS对照组比较，P＜0.01)，而存活期显著长于单独刺激治疗组或DC_(OVA)组或PBS对照组(与单独刺激治疗组或DC_(OVA)组或PBS对照组比较，P＜0.01)，且存活率显著提高。 3．用TLRs联合激活的DC瘤苗的治疗增强了荷瘤小鼠脾细胞的NK和CTL杀伤活性：TLR配体联合激活的DC_(OVA)(LPS+PolyI：C)组和DC_(OVA)(PolyI：C+CpG-ODN)组来源的小鼠NK细胞和CTL杀伤活性与用TLR配体单独激活的DC瘤苗治疗组相比显著增高(P＜0.01)。 4．用TLR3、4、9激活尤其是联合激活的DC瘤苗能诱导荷瘤小鼠产生更多的Th1型细胞因子(IL-2)的分泌：DC_(OVA)LPS组、DC_(OVA)PolyI：C组、DC_(OVA)CpG-ODN组、DC_(OVA)(LPS+PolyI：C)组、DC_(OVA)(PolyI：C+CpG-ODN)组，DC_(OVA)组上清中Th1型细胞因子IL-2的分泌量显著高于PBS对照组(P＜0.01)，而联合刺激组DC_(OVA)(LPS+PolyI：C)组和DC_(OVA)(PolyI：C+CpG-ODN)组Th1型细胞因子IL-2的分泌量显著高于DC_(OVA)LPS组或DC_(OVA)PolyI：C组或DC_(OVA)CpG-ODN组或DC_(OVA)组(与单独刺激组或DC_(OVA)组比较，P＜0.01)。 5．用TLR3、4、9激活尤其是联合激活的DC瘤苗能减少荷瘤小鼠脾细胞中的CD4~+CD25~+调节性T细胞比率。 结论 1．TLR配体联合激活的DC无论在表型还是功能上都具有更高的成熟度，且能分泌更多的IL-12、IL-23等细胞因子。 2．TLR配体联合激活的DC瘤苗能显著抑制肿瘤生长，并延长小鼠生存期，其可能的机制与增强荷瘤小鼠NK和CTL杀伤活性，并加强Th1型细胞因子分泌以及减少荷瘤小鼠脾细胞中的CD4~+CD25~+调节性T细胞比率有关。 3．TLR配体联合激活的DC瘤苗可望为开辟新型的基于DC的肿瘤疫苗提供了新的思路。
【图文】：

浙江大学硕士研究生论文我们在培养第6天将非成熟DC用OVA冲击并分别同LPS、PolyLc、CpG一ODN、(Lps+polyl:C)和(polyl:C+CPG一ODN)共培养，24h后将收集DC以细胞流式仪检测DC表面分子的表达情况。如图1所示，结果显示用TLR配体刺激后能显著促进DC成熟(与DCo琳组相比，尸均<0.01)，DC表面的enso、en86、en4o和Iab分子均明显上调。而经LPs和Po一yl:C、Polyl:C和CpG一ODN联合激活的DC具有更高的表型成熟度(同单独刺激组及DCovA组相比，P<0.01)。洲区一峨气;凡D一阮1!凡C一.小.韵，
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392;R730.5

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本文编号：2517596