人端粒酶逆转录酶肿瘤疫苗研究

发布时间：2019-07-23 10:15

【摘要】： 为了构建一种广谱的肿瘤疫苗，我们利用人端粒酶逆转录酶(hTERT)通用肿瘤抗原构建肿瘤疫苗。通过构建的hTERT趋化抗原基因疫苗、基因修饰瘤苗以及与共刺激分子的联合免疫途径研究其抗肿瘤效应和相关免疫机制。 我们利用抗原表位分析软件分析人端粒酶逆转录酶cDNA编码的全长蛋白序列，选取富含编码多种CTL和Th识别相关肽的大片段基因序列进行融合，组成新的抗原序列(简称Te)。为了增强免疫效果分别在抗原基因的上游连接编码CC亚族的趋化因子CCL21／SLC基因，在其下游连接IgG Fc基因片段，然后将整个融合片段插入到pcDNA3f表达质粒中构建趋化抗原DNA疫苗(pCCL21-Te-Fc)，同时建立该基因修饰的细胞瘤苗(B16／CCL21-Te-Fc)。RT-PCR和Western-Blotting分析表明，基因修饰瘤苗可以表达相应的融合蛋白，且表达的融合蛋白能够分泌到细胞外。体外淋巴细胞趋化实验证明人源CCL21不仅可以趋化人外周血淋巴细胞对小鼠脾淋巴细胞也具有很好的趋化活性，组织HE染色结果表明融合蛋白可以在体内趋化小鼠淋巴细胞。在表达hTERT基因的小鼠黑色素瘤(B16／Te)模型中，肿瘤治疗实验结果表明，DNA疫苗pCCL21-Te-Fc免疫可显著提高抗肿瘤免疫效果，但免疫小鼠在第52天全部死亡。而基因修饰瘤苗的肿瘤预防和治疗实验分别有37.5％和25％的免疫小鼠得到长期生存。 为了进一步提高抗肿瘤效果我们将细胞瘤苗与anti-4-1BB联合应用，结果表明无论在皮下肿瘤模型还是在肺转移模型中联合免疫均可显著提高抗肿瘤效果，，其中在小鼠皮下肿瘤模型中75％的免疫小鼠得到长期生存。再攻击实验未见肿瘤生长，表明anti-4-1BB可以诱导较强的免疫记忆。免疫后淋巴细胞删除实验证明在联合免疫过程中CD8~+ T细胞发挥主要抗肿瘤作用，同时CD4~+ T细胞和NK细胞发挥部分作用。体外混合淋巴细胞培养实验证明pCCL21-Te-Fc转染的人PBMC能有效的诱导自身淋巴细胞产生针对hTERT的特异性CTL，对不同组织来源hTERT高表达的人肿瘤细胞系有杀伤效果，提示该疫苗具有广谱抗肿瘤作用。
【图文】：

图2.连续PCR合成hTERT片段电泳示意图M:oeneRu一erTM一oobpLadderPlus;一:37sbp片段;32lbp片段;3:245bp片段;4:169bp片段:5:97bp片段序列测序结果示意图PCR合成378bphTERT片段序列测序示意图洲飞八tCOS仁为了!舀日飞ZM仁井(J八，以哟，之卜不1，只口Mt份飞一d匕1’1砂执、出切启l仍2闷八:斗门!称“口日甘~莎广少扒日咐沁，尸d、3小AOJ今才返尸晓犷，·。，以于C比，厂丫形、2矛t11夕4。fL产从卜，衍…;、、;;_一八{:、爪、已飞!，扣妇、、卜!!，一一只沛洲卜-

图5.质粒限制性内切酶酶切验证图谱pTe酶切图谱。l:DNAmarkerloobpLadder;2:EeoRI尼coRV双酶切质粒pTepsTe酶切图谱。l:DNAmarkerloobpLadder;2:EeoRI尼eoRV双酶切质粒psTepCCLZI一Te酶切图谱。l:入DNA/HindlllMarker:2:EeoRI尼eoRV双酶切质粒pCC3:DNAmarker100bPLadder
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R730.5;R392

【共引文献】

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本文编号：2518086