旋转超滤:一种提取细胞外泌体的新方法

发布时间：2019-08-14 12:35

【摘要】：目的建立一种利用旋转超滤技术从骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)培养上清液中分离外泌体(exosome)的方法。方法收集BMSCs细胞培养上清,低速离心去除残余细胞,0.22μm滤器过滤除去细胞碎片,采用旋转超滤技术提取外泌体。应用透射电子显微镜观察所获外泌体的形态,用蛋白质印迹法检测外泌体标记物CD63、CD9蛋白的表达,用CCK-8试剂盒检测外泌体对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖活性的影响。结果使用旋转超滤技术成功分离出BMSCs分泌的外泌体,透射电镜下外泌体为圆形或椭圆形,直径约100nm,蛋白质免疫印迹法检测结果显示外泌体中有其特异标记物CD63、CD9蛋白的表达。外泌体能够促进HUVECs增殖,并且其促细胞增殖作用随浓度增高而增强。结论旋转超滤技术是一种简单有效的提取外泌体的方法。
【图文】：

透射电镜,超微结构,来源

值。随后分别使用含有浓度为０、５、１０、２０、２００μｇ／ｍＬ外泌体的含ＬＳＧＳ的Ｍ－２００培养液培养细胞，于培养后１、３ｄ以同样的方法测定Ｄ４５０值。以Ｄ４５０值的平均值为纵坐标，孵育时间（ｄ）为横坐标，绘制细胞增殖曲线。２结果２．１外泌体的形态透射电镜下可见，ＢＭＳＣｓ来源的外泌体为大小均匀、形态一致的圆形或椭圆形膜性小囊泡，直径均为１００ｎｍ左右。染色后可见囊泡有完整的包膜，其内有低电子致密物（图１）。图１ＢＭＳＣｓ来源外泌体的超微结构Ｆｉｇ１ＵｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＢＭＳＣｓ－ｄｅｒｉｖｅｄｅｘｏｓｏｍｅＢＭＳＣｓ：Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ｏｒｉｇｉｎａｌｍａｇ－ｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ：×４００００（Ａ）；×２０００００（Ｂ）２．２外泌体的总蛋白定量结果使用ＢＣＡ法定量外泌体总蛋白，测得样品蛋白浓度约为（３７０．０±１２．５）μｇ／ｍＬ。每１０６个ＢＭＳＣｓ的细胞上清液中平均能提取约７．２μｇ外泌体。２．３ＣＤ９、ＣＤ６３蛋白在外泌体中的表达蛋白质免疫印迹法检测结果显示，ＢＭＳＣｓ来源的外泌体表达ＣＤ９、ＣＤ６３蛋白（图２）。该结果进一步证实了ＢＭＳＣｓ外泌体的存在。图２ＣＤ９、ＣＤ６３蛋白在ＢＭＳＣｓ来源外泌体中的表达Ｆｉｇ２ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＤ９ａｎｄＣＤ６３ｐｒｏｔｅｉｎｉｎＢＭＳＣｓ－ｄｅｒｉｖｅｄｅｘｏｓｏｍｅａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓＢ

增殖作用,来源,超滤

ｆＣＤ９ａｎｄＣＤ６３ｐｒｏｔｅｉｎｉｎＢＭＳＣｓ－ｄｅｒｉｖｅｄｅｘｏｓｏｍｅａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓＢＭＳＣｓ：Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ２．４外泌体对ＨＵＶＥＣｓ增殖作用的影响ＣＣＫ－８法检测结果显示，培养１、３ｄ时，通过旋转超滤方法提取的外泌体能提高ＨＵＶＥＣｓ的体外增殖能力，在０～２００μｇ／ｍＬ外泌体浓度范围内，外泌体浓度越高，ＨＵＶＥＣｓ的增殖能力越强（图３）。说明旋转超滤法能提取到有生物学功能的外泌体，外泌体中含有的某些物质具有促进细胞增殖的作用。图３不同浓度ＢＭＳＣｓ来源外泌体对ＨＵＶＥＣｓ增殖作用的影响Ｆｉｇ３ＥｆｆｅｃｔｏｆＢＭＳＣｓ－ｄｅｒｉｖｅｄｅｘｏｓｏｍｅ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）ｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＨＵＶＥＣｓＢＭＳＣｓ：Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；ＨＵＶＥＣｓ：Ｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｖｅｉｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ３讨论旋转超滤技术分离外泌体是利用超滤膜孔径的大小对不同相对分子质量的物质进行允许及拦截的原理，将溶剂及部分小分子物质过滤到膜的另一侧，而将大于膜孔径的高相对分子质量物质截留在超滤膜上，从而达到分离的目的，与离心超滤分离外泌体的原理相似。不同的是，离心超滤是利用离心力将溶剂及小分子溶质分离出去，仍然需要在１０００００×ｇ条件下离心１～２ｈ来获得外泌体［８］。而本研究所介绍的方法是通过氮气产生的压力将细胞上清液经１０００
【作者单位】：南昌大学第二附属医院神经外科;上海交通大学医学院附属第六人民医院四肢显微外科研究所;上海交通大学医学院附属第六人民医院神经外科;
【基金】：国家自然科学基金(81272170) 江西省创新团队计划(20113BCB24018)~~
【分类号】：R329.28

【共引文献】