应用HMGB1特异性拮抗物延长同种移植物存活时间的研究

发布时间：2019-08-17 10:29

【摘要】： 急性排斥反应是导致临床同种移植术失败的主要原因。一般认为，T细胞应答及其效应是介导急性排斥反应发生的主要机制。 已证实：T细胞激活有赖于双信号，即TCR特异性识别抗原提呈细胞(APC)所提呈抗原肽而产生的第一信号，以及APC与T细胞表面共刺激分子相互作用所提供的第二信号。由此可见，APC在T细胞应答过程中占据重要地位。近10年来提出了危险模式理论(danger model theory)，从固有免疫和获得性免疫相互关系的角度强调了APC在T细胞激活过程中的重要作用，其要点是：各种导致组织损伤的触发剂(即危险信号)均可诱导APC活化并表达共刺激分子，从而提供T细胞活化的第二信号。换言之，组织损伤所致的危险信号是激活APC、继而激活T细胞的关键环节。 同种器官移植中，由于外科手术、缺血／缺氧和缺血再灌注等因素，使受者体内出现细胞应激和炎性“瀑布式”反应，可产生多种内源性危险信号，，从而激活APC并诱导同种反应性T细胞活化。因此，阻断内源性危险信号乃抑制移植排斥反应的重要策略。 高迁移率族蛋白B1(HMGB1，high mobility group box 1)是一种核内蛋白，在30余年前已被发现。其组成性表达于各种组织细胞的胞核内，具有多种重要的核内功能。近年发现，HMGB1也可出现于胞外，其来源为：由坏死细胞(而非凋亡细胞)被动释放，或由受刺激的单核／巨噬细胞主动分泌。释放至胞外的HMGB1可与多种免疫细胞相互作用，直接介导非特异性炎症反应，也可作为内源性危险信号激活APC[主要是树突状细胞(DC)]，从而启动、增强特异性免疫应答，并参与多种疾病过程发生和发展。 实验研究中，阻断胞外HMGB1的活性，已成为干预相关疾病过程的重要策略。HMGB1的截短形式A盒蛋白和抗HMGB1中和抗体均为HMGB1拮抗物，可特异性逆转HMGB1的胞外活性。使用该两种拮抗物，可缓解实验性关节炎及脓毒血症病情，提高实验动物存活率。 本课题通过建立小鼠同种腹部异位心脏移植模型，观察急性移植排斥反应中移植物HMGB1表达，探讨HMGB1与急性排斥反应的相关性；在此基础上，制备并应用HMGB1的特异性拮抗物GST-A box重组蛋白，观察对移植物存活时间的影响，并初步探讨其机制。 一、HMGB1表达与同种急性排斥反应相关性 实验分组为：①异基因心脏移植组，供者为BALB／C近交系小鼠，受者为C57BL／6近交系小鼠；②同基因心脏移植组，供者为和受者均为C57BL／6近交系小鼠。 前期实验证明：异基因心脏移植组移植物平均存活时间为7.67±1.03天，同基因心脏移植组未出现排斥反应。在移植后1d、3d、7d观察如下指标：移植心脏中炎性细胞浸润、移植心脏HMGB1 mRNA表达水平、移植心脏炎性细胞因子mRNA表达水平。结果如下： 1．术后1d，同种移植心脏HMGB1和TNF-α的mRNA表达即升高，但与同系对照表达相当，两组中IFN-γ表达均未上调； 2．术后3d，HMGB1和TNF-α表达持续上升，术后7天表达量达高峰，与同系对照相比，差异有显著性(P＜0.05)； 3．术后7d，同种移植心脏IFN-γ的mRNA表达上调，与同系对照相比，差异有显著性(P＜0.05)； 以上结果表明：HMGB1可能是一种排斥反应相关因子，其不仅与TNF-α共同参与移植术后早期发生的非特异性炎症应答，且可能与其后的急性排斥反应(即同种抗原特异性应答)有关。 二、HMGB1特异性拮抗物GST-A box的制备、纯化和功能鉴定 成功构建PGEX-4T-2-A box原核表达载体，并通过原核表达获得大量GST-Abox重组蛋白；借助亲和纯化及去内毒素处理，重组蛋白纯度和特异性大大增强；生物学实验证实，GST-A box可有效拮抗HMGB1的生物学功能。 三、应用HMGB1特异性拮抗物可延长移植心脏存活时间 借助腹腔注射，术前1d至术后4d每天向受者体内输入100μl(1mg)GST-A box重组蛋白，以干预同种排斥反应，并设立GST对照组和空白对照组，于术后7d及／或移植心脏停跳时检测如下指标： 1．GST-A盒重组蛋白对异基因移植心脏存活时间的影响 应用GST-A盒重组蛋白能明显延长移植心脏存活时间，实验组平均存活时间为12.5±1.87天，与阴性对照组(6.5±1.04天)和空白对照组(7.67±1.03天)相比有显著性差异(p＜0.05)。 2．移植心脏HE染色 与对照组相比，GST-A box处理组心肌细胞间淋巴细胞浸润明显减少，未出现毛细血管淤血、间质出血、动脉炎和静脉炎等现象。 3．GST-A盒重组蛋白对受者小鼠脾脏DC共刺激分子表达的影响 借助流式细胞术分别检测移植后6天各组受者小鼠脾脏DC共刺激分子CD80、CD86表达，结果表明： *与GST组对照组(MFI=149.97)和NS对照组(MFI=122.92)相比，GST-Abox处理组脾脏DC表达CD80明显下调(MFI=44.94)，差异有显著性(p＜0.05)； *与GST组对照组(MFI=305.62)和NS对照组(MFI=274.15)相比，GST-Abox处理组脾脏DC表达CD86下调(MFI=242.83)，但差异无显著性(p＞0.05)。 4．GST-A盒重组蛋白对受者小鼠脾脏IFN-γ分泌细胞数量的影响 借助细胞内流式细胞术分别检测移植后7天各组受者小鼠脾脏IFN-γ分泌细胞的数量，结果如下： * GST-A box处理组、GST对照组和生理盐水对照组Th1细胞(CD4~+IFN-γ~+)分别为11.35％、17.35％和12.41％，差异不明显； * GST-A box处理组Tc1细胞(CD8~+IFN-γ~+)为22.96％，明显少于GST组对照组(33.23％)和生理盐水对照组(35.57％)。 5．移植心脏HMGB1和细胞因子mRNA表达 术后1d、3d、7d分别采取各组移植心脏组织，提取总RNA，借助实时定量RT-PCR技术检测HMGB1、TNF-α、和IFN-γ的mRNA表达水平，结果如下： * GST组和NS组各时段HMGB1、TNF-α和IFN-γ的mRNA表达水平相近，差异无显著性； *与上述两组相比，术后3d和7d GST-A box处理组HMGB1及TNF-α的mRNA表达水平明显降低，差异有显著性(p＜0.05)； *与上述两组相比，术后7d GST-A box处理组IFN-γ的mRNA表达水平明显降低，差异有显著性(p＜0.05)。 以上结果表明：GST-A box重组蛋白具有抗排斥效应，其抗排斥反应的机制与下调受者脾脏DC共刺激分子表达、阻抑Tc1细胞极化及下调移植物HMGB1和炎症性细胞因子表达有关。 四、GST-Abox延长移植物存活的机制 1．GST-A box重组蛋白对LPS刺激所致DC成熟的影响 用GST-A box重组蛋白与LPS、未成熟DC共孵育24h后检测DC表型，结果表明：应用GST-A box重组蛋白后，表达MHCⅡ类分子、CD80和CD86阳性的DC细胞数分别为27.16％、41.19％和47.05％，与LPS刺激组相比有显著性差异(p＜0.01)，表明GST-A box重组蛋白可拮抗LPS诱导的DC成熟。 2．LPS可刺激DC主动分泌HMGB1 *用1μg／ml LPS刺激未成熟DC(C57BL／6小鼠骨髓来源)24hr，借助免疫细胞化学技术和激光共聚焦显微镜检测HMGB1在DC细胞中的亚细胞定位，结果表明：LPS刺激后，HMGB1在DC细胞中定位发生变化，由胞核向胞浆迁移； *在刺激前(Ohr)、刺激后8、16、24hr分别取细胞上清和刺激前后的细胞沉淀，进行Western-blot检测，结果表明：刺激前后DC细胞总HMGB1水平无差别，刺激后8hr细胞上清中即可检出HMGB1，且呈时间依赖性逐渐增加，至24hr达到高峰。以上结果表明：LPS可刺激DC主动分泌HMGB1。 3．GST-A box重组蛋白可抑制单向混合淋巴细胞反应 用未成熟DC与LPS、GST-A box重组蛋白预孵育8hr后，与同种T细胞进行混合淋巴细胞培养，~3H-TdR掺入法检测T细胞增殖，结果表明：LPS刺激后的DC细胞可明显促进异基因T淋巴细胞增殖；GST对该效应无影响；而GST-A box重组蛋白则可拮抗此效应。 以上结果提示：非成熟DC转变为成熟DC过程中，能自分泌HMGB1，后者对DC进一步成熟具有重要意义；GST-A box延长移植心脏存活的机制之一可能与阻抑DC表型和功能成熟有关。 结论 1．HMGB1与急性排斥反应的发生相关，其既可通过“HMGB1-巨噬细胞-TNF-α-巨噬细胞-HMGB1”这一正反馈机制参与移植术后非特异性炎症反应；亦可刺激DC成熟，诱导同种抗原特异性免疫应答发生； 2．GST-A box重组蛋白能有效延长同种移植心脏存活时间，本文为临床上借助抗HMGB1策略防治移植排斥反应提供了依据。
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三、移植心脏HMGBI和细胞因子mRNA表达取各时段移植心脏组织，提取总RNA，借助实时定量RT-PCR技术检测HMGBI、TNF一a、和『N一Y的mRNA表达水平，结果如图1一2所示:1.异基因移植组术后 ldHMGBI表达上调，与同基因移植组相近;术后3dHMGBI表达明显上调，7d达高峰，与同基因移植组相比，差异有显著性(p<0.05);2.异基因移植组术后 ldTNF一Q表达上调，与同基因移植组相近;术后 3dTNF-。表达明显上调，7d达高峰，与同基因移植组相比，差异有显著性(p<0.05);3.异基因和同基因移植组术后ld和3dIF刊一Y表达均无明显变化;异基因移

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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R392;R617

【参考文献】

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1 姚咏明,盛志勇;高迁移率族蛋白-1在脓毒症发病中的作用与意义[J];解放军医学杂志;2002年09期

2 杨智勇,王春友,熊炯p

本文编号：2527731