S100A4蛋白在感觉神经元再生以及损伤诱导的白质星形胶质细胞迁移过程中的作用

发布时间：2019-08-17 19:07

【摘要】： 星形胶质细胞(astrocytes，Ast)在中枢神经系统发育和正常生理功能的维持中具有重要作用。根据Ast在CNS内的分布，将其分为白质Ast和灰质Ast。灰质Ast主要与神经元协作形成突触网络，白质Ast则参与维持髓鞘化和非髓鞘化轴突上长距离冲动传导的安全性。Ast在CNS损伤和疾病中也发挥极其重要的作用。例如Ast参与形成胶质瘢痕(glial scar)，修复损坏的胶质边界以及血脑屏障等。反应性白质Ast参与形成CNS微环境进而影响神经再生，参与损伤后胶质瘢痕的形成，促进少突胶质细胞有效地再髓鞘化等。成年哺乳动物白质Ast表达S100A4蛋白，而灰质Ast不表达该蛋白。机械损伤导致白质退形性变时，白质Ast S100A4表达量明显升高。然而，目前尚不清楚S100A4蛋白在CNS内的具体作用。第一部分S100A4蛋白在感觉神经元再生过程中的作用早先的体外实验发现，外源性给予S100A4蛋白处理可明显刺激胎鼠海马神经元突起生长，保护胎鼠中脑及新生鼠大脑皮质神经元。然而，这些结果均来自纯的神经元培养条件，没有神经元-星形胶质细胞之间的相互交流。因此，本研究采用神经元-星形胶质细胞共培养体系，该培养条件能较好地反映在体的实际情况。首先，我们研究白质Ast对背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)细胞突起生长的影响；接着，进一步研究白质Ast内、外S100A4蛋白在DRG细胞突起再生过程中的作用。结果如下： 1．DRG细胞在多聚-L-赖氨酸包被的coverslip上的生长情况我们首先检测成年Wistar大鼠DRG细胞在多聚-L-赖氨酸包被的coverslip(没有星形胶质细胞)上的生长情况。在该培养条件下，DRG细胞可以存活，但培养24h未见神经元出芽。 2．DRG细胞与对照siRNA预处理的白质星形胶质细胞共培养，DRG细胞突起生长情况接下来，我们研究当DRG细胞与表达S100A4蛋白的白质Ast共同培养时，DRG细胞突起生长情况。免疫印迹检测提示：对照siRNA处理的白质Ast表达但不向胞外分泌S100A4蛋白。免疫荧光检测发现：共培养6h后，DRG细胞未长出突起；共培养12h后，DRG细胞长出较短的突起；共培养18h，DRG细胞突起数量、长度增加；共培养24h，可以看到DRG细胞长出粗且长的树枝状突起。对比DRG细胞在多聚-L-赖氨酸包被的coverslip上的生长情况，提示白质Ast能支持成年DRG细胞突起生长。 3．DRG细胞与S100A4 siRNA处理的白质星形胶质细胞共培养，DRG细胞突起生长情况为阐明胞内S100A4蛋白的作用，我们将DRG细胞与S100A4 siRNA处理的白质Ast共培养，观察DRG细胞突起生长情况。经S100A4 siRNA转染，3d后白质Ast不再表达S100A4蛋白，这时，我们将分散的DRG细胞与其共同培养。共培养6h，未见DRG细胞长出突起；共培养12h，可以观察到DRG细胞长出突起；共培养18h、24h，DRG细胞再生突起长度继续增加。定量统计分析显示：共培养12、18、24h，与S100A4 siRNA处理白质Ast共培养的DRG细胞突起要明显长于与对照siRNA处理白质Ast共培养的DRG细胞突起。提示白质Ast内的S100A4蛋白抑制成年DRG细胞突起生长。 4．DRG细胞与S100A4蛋白处理的白质星形胶质细胞共培养，DRG细胞突起生长情况为研究胞外S100A4蛋白是否影响与白质Ast共培养的DRG细胞突起生长，首先，我们制备纯的白质Ast，加入重组的S100A4蛋白(5μg／ml)预处理2h，然后将分散的DRG细胞种于其上，共同培养。早先的体外研究报道5μg／ml是S100A4蛋白促进神经突起生长的最佳浓度。共培养6h，未见DRG细胞长出突起；共培养12h，DRG细胞长出较长的突起；共培养18h、24h，DRG细胞突起还在继续向外伸展。定量统计分析显示：共培养12、18、24h，，S100A4处理组DRG细胞突起明显长于对照siRNA处理组。而且共培养18h，S100A4处理组DRG细胞突起比S100A4 siRNA处理组还要长。提示与胞内S100A4蛋白的作用相反，胞外S100A4蛋白刺激神经突起生长。结论本研究发现：白质Ast能帮助DRG细胞突起生长；白质Ast胞内的S100A4蛋白抑制DRG细胞突起生长；胞外的S100A4蛋白可有效克服白质Ast胞内S100A4蛋白对DRG细胞突起生长的抑制作用，从而促进神经再生。第二部分S100A4蛋白在损伤诱导的白质星形胶质细胞迁移过程中的作用成年哺乳动物白质Ast表达S100A4蛋白，而灰质Ast不表达该蛋白；机械损伤导致白质退形性变时，白质Ast S100A4表达量明显升高。最近的研究报道，离体条件下抑制白质Ast S100A4表达能增加Ast的迁移能力，S100A4蛋白有可能影响Ast对于诸如正常组织完整性破坏之类病理事件的反应。本研究，我们通过在离体和整体水平比较S100A4(+／+)、S100A4(-／-)白质Ast对于机械损伤(scratch)、化学损伤(ethidium bromide)的反应，研究S100A4蛋白对于损伤诱导的白质Ast迁移的影响，及其在损伤后胶质瘢痕形成中的作用。 1．细胞培养条件下，胞内S100A4蛋白对scratch损伤诱导的白质星形胶质细胞迁移的影响取自P4大鼠脑胼胝体区的Ast(白质Ast)表达较高水平的S100A4蛋白。用S100A4 siRNA转染3d后，白质Ast S100A4表达水平下降90％以上。对照siRNA转染的白质Ast S100A4表达水平没有明显改变。Scratch 24h后，在对照siRNA转染组损伤区附近，白质Ast表达S100A4水平上调，其突起朝损伤部位延伸；Scratch 48h后，表达S100A4的Ast再生突起已长至损伤所造成的缺损区，但没有完全覆盖该部位。 S100A4 siRNA处理后，Scratch 24、48h，未见白质Ast表达S100A4。损伤24h，白质Ast已迁移至损伤部位；Scratch 48h后，白质Ast已完全填满缺损区。定量分析显示，S100A4 siRNA处理组损伤24、48h，发生迁移的Ast数量明显多于对照siRNA处理组(P＜0.05)。 2．动物水平，胞内S100A4蛋白对ethidium bromide注射诱导的白质星形胶质细胞迁移的影响向S100A4(+／+)和S100A4(-／-)小鼠单侧脊髓背索注射溴乙啶(ethidium bromide)，注射侧出现脱髓鞘化以及胶质细胞坏死，对侧也有一定程度的类似反应。S100A4(+／+)和S100A4(-／-)小鼠损伤程度相似。损伤4d后，S100A4(+／+)和S100A4(-／-)小鼠Ast反应相似，但在S100A4(+／+)小鼠可见一些Ast聚集在损伤区边缘。EB注射7d后，S100A4(+／+)小鼠脱髓鞘区边缘有肥大的Ast聚集，而在此阶段，S100A4(-／-)小鼠Ast已迁移至脱髓鞘区域内。结论本研究发现，S100A4(-／-)白质Ast迁移至脱髓鞘区的能力比S100A4(+／+)白质Ast强。S100A4蛋白不但抑制由损伤诱导的CNS反应性白质Ast的迁移，而且参与损伤后胶质瘢痕的形成。
【图文】：

流程图,转染,流程,固定细胞

图2siRNA转染流程光胞与白质Ast共同培养6，12，18，24h后，行免疫下:养基，用pBS(NaZHpO;1.449，KHZpO40.249，KCI馏水定容至1000ml，pll7.4)漂洗两次;(一边吸鲜PBS;注意不要把PBS直接加到细胞上，也不要使甲醇一20℃预冷，一20℃固定细胞5min;ritonPBS(0.PBS(0.2mlTriton/IOOmliton5mlTriton/IO0mlPBS)漂洗PBS)破膜3火5min5一10minritonPBS漂洗3X5min，5%BSA(59BSA/10OmlP
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R363

【参考文献】