丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A与细胞蛋白FKBP38相互作用及对细胞凋亡影响的研究

发布时间：2019-08-24 14:11

【摘要】： 丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)是一个全球性的危害人类健康的重要病原体，感染机体后极易导致慢性肝炎、并引起肝纤维化、肝硬化、肝坏死，最终导致肝癌。目前对于丙型肝炎病毒致病机制的了解仍然非常有限。研究发现丙型肝炎病毒的致病性除了病毒本身因素外，病毒蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用在其中发挥重要作用。在组成病毒的结构蛋白(Structural Protein)和非结构蛋白中(Non-structural Protein)，非结构蛋白5A(NS5A)通过与细胞蛋白的相互作用在信号转导、胞内物质转运、抗细胞凋亡以及其它的一些方面发挥了重要作用，并且许多相互作用的后果都能维持或促进病毒在细胞内的持续复制，但其详细机制有待进一步明确。本文以NS5A蛋白为钓饵，通过筛选人胎肝细胞cDNA基因文库，寻找与HCV NS5A蛋白相互作用的细胞蛋白，在此基础上进一步确认NS5A与细胞蛋白的相互作用并研究其生物学意义。 首先构建了HCV NS5A酵母表达质粒，并利用Gal4酵母双杂合系统对人胎肝细胞cDNA文库进行筛选。通过第一轮筛选初步获得阳性候选克隆后，将上述克隆再次分别与NS5A钓饵质粒共转化酵母细胞进行第二轮验证，获得十二个阳性克隆。测序后通过Blast检索发现这十二个克隆含有两个cDNA序列，分别编码38kD免疫抑制剂FK506结合蛋白(38kD immunosuppmssant FK506-bindingprotein，FKBP38)和ADP核糖基化样因子6的作用蛋白(ADP-ribosylation-likefactor-6 interacting protein 1，Aip-1)。已有文献报道，NS5A可以通过不同途径抑制细胞凋亡，而FKBP38能通过其跨膜端将Bcl-2抗凋亡家族的两个分子Bcl-2和Bcl-xL锚定到线粒体外膜上从而发挥抗凋亡作用。由此可以推测NS5A与FKBP38的相互作用有可能参与抑制细胞凋亡，值得作进一步研究。为进一步验证NS5A与FKBP38的相互作用，首先通过体外翻译获得~(35)S标记的NS5A和带HA标签的FKBP38。免疫共沉淀结果显示在HA抗体存在下，NS5A和HA-FKBP38在体外可发生物理上的结合。进一步构建NS5A-myc和HA-FKBP38真核表达质粒并共转Cos7非洲绿猴肾细胞，结果发现无论是加入myc抗体还是佸抗体，这两个蛋白始终在免疫复合物中被检测到。进一步在HCV亚基因组复制子细胞的裂解液中，加入上述蛋白抗体也获得同样结果。同时，通过免疫共沉淀还发现FK506并不影响上述两个蛋白的结合。然后应用免疫荧光和激光共聚焦扫描确认两者在细胞内的相互作用。结果显示无论是瞬时共转还是在HCV亚基因组复制子细胞中，这两个蛋白均存在于胞浆的相同位点。进一步利用亚细胞器特异性染料和标志蛋白进行激光共聚焦发现FKBP38定位于内质网和线粒体，而NS5A定位于内质网并有部分存在于线粒体。进一步运用Gal4酵母双杂合系统和激光共聚焦进行突变体分析，，发现NS5A的148-236位氨基酸参与了和FKBP38的相互作用，且这一片断包含一个Bcl-2同源区；而FKBP38的跨膜区对它与NS5A的结合也至关重要。上述结果证明NS5A和FKBP38之间存在直接的相互作用。 为研究NS5A与FKBP38相互作用对细胞凋亡的影响，建立了表达NS5A的Huh7-NS5A稳定细胞株。利用该细胞株和HCV亚基因组复制子细胞，发现这两种细胞都能抑制凋亡诱导剂引起的细胞凋亡；当用siRNA干扰技术抑制HCV亚基因组复制子细胞中的NS5A后，复制子细胞部分恢复凋亡敏感性，提示NS5A具有抗凋亡活性。另一方面，利用siRNA干扰技术抑制内源性FKBP38表达后发现这两种细胞部分恢复对凋亡诱导剂的敏感，而对照细胞无明显差异，提示NS5A的这种抗凋亡活性依赖于FKBP38。在Huh7-NS5A稳定细胞株中通过siRNA干扰FKBP38后检测凋亡诱导剂诱导凋亡后PARP剪切体的量，发现稳定细胞株中被剪切的PARP量明显较少，说明NS5A的抗凋亡作用可能是通过稳定线粒体的方式实现。鉴于Bcl-2在Huh7细胞中缺如，以上结果提示在Huh7细胞中NS5A可能发挥类似抗凋亡分子Bcl-2的作用，并且这种作用可能是通过FKBP38实现。 综上所述，本文应用Gal4酵母双杂合系统以HCV NS5A为诱饵对人胎肝cDNA文库进行了筛选，发现FKBP38是NS5A的相互作用蛋白．在确认NS5A与FKBP38相互作用的基础上，研究了这种相互作用对细胞凋亡的影响，发现了NS5A抑制细胞凋亡可通过FKBP38所介导，提出了NS5A抑制细胞凋亡一种新的途径，丰富了对NS5A抗凋亡机制的认识，为进一步研究病毒蛋白与细胞蛋白之间的相互作用，阐明HCV的致病机制打下了良好基础。
【图文】：

/X一a一Gal(20ug/ml)平板上仅PGBKT7一NSSA与pACTZ一FKBP38的共转化子及阳性对照组可见蓝色菌落，其它空载体及阴性对照组均不变蓝，也无明显生长迹象(图1.3.)。说明NSSA或FKBP38的单独表达都无法激活酵母报道基因的表达，报道基因的激活依赖于Ns5A与FKBP38的相互作用。SD/一TrP一 LeuSD/一Trp一Leu一His一Ade/3一AT图1.2.酵母转化生长实验两图中从上至下六组菌落依次为下列共转化子 :(1)pGBKT7+pAcTZ;(2)pGBKT7一NSSA+pACTZ一FKBP38:(3)PGBKT7一 NSSA+PACTZ;(4)pGBKT7+pACTZ一FKBp38;(5)阳性对照:pGBKT7一p53+pGADT7一T;(6)阴性对照:pGBKT7一lam+pGADT7一T

Ns5A与细胞蛋白FKBP38相互作用的确认及胞中NSSA和内源性的FKBP38是否在HCV感染的生理情况下同基因组复制子细胞作为研究对象DNA3舰A一FKBP38，转染48小时小鼠正常血清)沉淀免疫复合物，显示，内源性的Ns5A与过表达的HCVRePlicon细胞裂解液作免性的FKBP38同样存在直接的相下NSSA可以和FKBP38发生相InPut
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R373

【共引文献】

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本文编号：2529015