分子佐剂C3d3增强hCGβDNA和粘膜疫苗体液免疫效应的机制

发布时间：2019-08-24 17:20

【摘要】： 研究背景基于hCGβ的避孕疫苗，是目前唯一完成Ⅱ期临床试验的避孕疫苗。但尚面临许多困难，必须寻找更理想的载体、分子佐剂，合适的免疫途径，以增强它的免疫原性，提高其避孕效果。C3d分子通过与B细胞表面CD21分子的直接结合而发挥生物学作用，因此C3d作为分子佐剂，为解决人群中的个体差异创造机遇，并恰好符合避孕疫苗追求体液免疫效应的目标。本实验室在以往的研究中，将C3d3与hCGβ基因融合，成功构建了hCGβDNA疫苗pCMV4-hCGβ-C3d3、hCGβ粘膜疫苗Lb.hCGβ-C3d3。并且证明分子佐剂C3d3可明显增强避孕疫苗的体液免疫效应及抗生育作用。但这两种疫苗作用的分子机制尚不明了，分子佐剂C3d3的作用机制尚不清楚。 目的本研究用hCGβDNA疫苗和hCGβ粘膜疫苗分别经小鼠肌肉注射免疫和阴道粘膜接种，观察这两种疫苗在小鼠全身和生殖道局部的抗hCGβ体液免疫效应，观察分子佐剂C3d3对免疫反应的作用；分析ASC表面和组织局部的趋化因子／受体和粘附分子配体／受体，探讨ASC游走以及ASC归巢至生殖道的分子机制，以解析hCGβDNA疫苗和粘膜疫苗的抗生育作用。 分子佐剂C3d3通过上调B细胞CXCR4和CD62L的表达及促进ASC游走而增强hCGβDNA疫苗体液免疫效应 方法将hCGβDNA疫苗pCMV4-hCGβ-C3d3、pCMV4-hCGβ和pCMV4分别肌肉注射BALB／c小鼠。间接ELISA法测定抗hCGβ血清／阴道灌洗液抗体效价；ELISPOT分析小鼠脾脏和子宫的抗体分泌细胞；RT-PCR分析小鼠脾脏B细胞17种趋化因子受体及脾脏组织中相关配体的转录；FCM分析CXCR4蛋白水平；ELISA检测CXCL12的分泌；趋化试验观察CXCL12对外周血B细胞的趋化作用；迁移试验观察CXCL12趋化各免疫组脾脏局部B细胞，再ELISPOT检测趋化下来的ASC数目；FCM分析脾脏局部B细胞粘附分子CD62L／VLA／LFA的表达；免疫组化分析脾脏相关粘附分子受体MAdCAM／VCAM／ICAM的表达。 结果在DNA免疫中，pCMV4-hCGβ-C3d3产生抗hCGβIgG血清抗体明显高于pCMV4-hCGβ；抗hCGβIgA血清抗体两组无明显差异；pCMV4-hCGβ-C3d3产生的阴道灌洗液抗hCGβIgG／IgA抗体水平较低，与pCMV4-hCGβ比较无明显差异；pCMV4-hCGβ-C3d3脾脏抗hCGβIgG ASC明显高于pCMV4-hCGβ，脾脏IgA ASC与子宫IgG／IgA ASC两组间无明显差异。 经DNA免疫后，脾脏B细胞CXCR4在pCMV4-hCGβ-C3d3和pCMV4-hCGβ免疫后明显升高，且pCMV4-hCGβ-C3d3明显高于pCMV4-hCGβ；CXCR4的配体CXCL12在粘膜免疫后脾脏组织中亦明显升高，但pCMV4-hCGβ-C3d3与pCMV4-hCGβ无明显差异。因此，C3d3能显著上调脾脏ASC表达CXCR4，但并不能明显提高脾脏局部CXCL12的表达。趋化试验提示，pCMV4-hCGβ和pCMV4-hCGβ-C3d3脾脏组织上清均能明显趋化外周血B细胞，但两组间无明显差异，抗SDF-1抗体可部分阻断趋化作用。迁移试验结果显示，SDF-1能明显趋化pCMV4-hCGβ-C3d3和pCMV4-hCGβ组脾脏局部的B细胞，且pCMV4-hCGβ-C3d3组趋化的B细胞明显比pCMV4-hCGβ组多，加用抗CXCR4抗体后，SDF-1对免疫组脾脏B细胞的趋化作用与对照组无明显差异，用被趋化的B细胞作ELISPOT，pCMV4-hCGβ-C3d3组ASC明显多于pCMV4-hCGβ组，说明C3d3升调节ASC表达CXCR4，增加ASC对CXCL12的反应性，促进ASC游走。FCM分析脾脏B细胞粘附分子发现，在各免疫组LFA和VLA表达较低，且各组间无明显差异，而CD62L在各免疫组均有表达，pCMV4-hCGβ-C3d3和pCMV4-hCGβ组明显高于对照组，且pCMV4-hCGβ-C3d3组显著高于pCMV4-hCGβ组。免疫组化分析脾脏相关粘附分子受体发现，MAdCAM／VCAM／ICAM在各免疫组均有表达，但各组间无明显差异。 结论hCGβDNA疫苗主要在全身产生体液免疫应答。C3d3能增强系统性体液免疫效应。DNA疫苗促进ASC高表达CXCR4、CD62L，增加对CXCL12的反应性，通过CD62L／MAdCAM的相互作用，有利于ASC游走。 分子佐剂C3d3通过上调B细胞CCR9和VLA的表达及促进ASC归巢而增强hCGβ粘膜疫苗体液免疫效应 方法将重组乳酸杆菌Lb.pIlac、Lb.hCGβ、Lb.hCGβ-C3d3分别经阴道接种BALB／c小鼠。间接ELISA法测定抗hCGβ血清／阴道灌洗液抗体效价；ELISPOT分析小鼠脾脏和子宫的抗体分泌细胞；RT-PCR分析子宫B细胞17种趋化因子受体及子宫组织中相关配体的转录；FCM分析CCR9蛋白水平；ELISA检测CCL25的分泌；趋化试验观察CCL25对外周血B细胞的趋化作用；迁移试验观察CCL25趋化各免疫组子宫局部B细胞，再ELISPOT检测趋化下来的ASC数目；FCM分析子宫局部B细胞粘附分子CD62L／VLA／LFA的表达；免疫组化分析子宫相关粘附分子受体MAdCAM／VCAM／ICAM的表达。 结果在粘膜免疫中，Lb-hCGβ-C3d3免疫组血清抗hCGβIgG抗体水平明显高于Lb．hCGβ组；血清抗hCGβIgA抗体两组无明显差异；Lb．hCGβ-C3d3免疫组阴道灌洗液抗hCGβIgG及IgA抗体比Lb．hCGp明显增高。Lb．hCGβ-C3d3和Lb．hCGβ免疫组脾脏抗hCGβIgG／IgA ASC无明显差异；Lb．hCGβ-C3d3免疫组子宫抗hCGβIgG及IgAASC均明显高于Lb．hCGβ组。 经粘膜免疫后，子宫局部B细胞CCR9在Lb．hCGβ和Lb．hCGβ-C3d3免疫后明显升高，且Lb．hCGβ-C3d3明显高于Lb．hCGβ；CCR9的配体CCL25在粘膜免疫后子宫组织中明显升高，但Lb．hCGβ-C3d3与Lb．hCGβ无明显差异。说明C3d3能显著上调子宫局部B细胞表达CCR9，但不能明显提高子宫局部CCL25的表达。趋化试验显示：Lb．hCGβ和Lb．hCGβ-C3d3免疫组子宫组织上清均能明显趋化外周血B细胞，，但是两组间无明显差异，加用TECK抗体可部分阻断趋化作用。迁移试验结果显示，TECK能明显趋化Lb．hCGβ和Lb．hCGβ-C3d3组子宫局部的B细胞，且Lb．hCGβ-C3d3组趋化的B细胞明显比Lb．hCGβ组多，用被趋化的B细胞作ELISPOT，Lb．hCGβ-C3d3组ASC明显多于Lb．hCGβ组。说明C3d3升调节ASC表达CCR9，通过CCR9／CCL25相互作用，增加ASC归巢到生殖道局部。FCM分析子宫B细胞粘附分子发现，在各免疫组CD62L均有表达，但各组间无明显差异；LFA在各免疫组也都有表达，但是表达较低，且各组间无明显差异；VLA在各免疫组均有表达，Lb．hCGβ和Lb．hCGβ-C3d3组明显高于对照组，且Lb．hCGβ-C3d3组B细胞VLA表达较Lb．hCGβ组为高，差异有显著性。免疫组化分析子宫局部相关粘附分子受体发现，MAdCAM在各免疫组均未见明显表达；VCAM只在Lb．hCGβ-C3d3组子宫中有表达；ICAM在各免疫组均有表达，但各组间无明显差异。 结论hCGβ粘膜疫苗不仅能够在小鼠全身，还能够在生殖道局部产生较强的体液免疫效应，C3d3能增加粘膜免疫后体液免疫效应。粘膜疫苗尤其是Lb．hCGβ-C3d3，使生殖道局部ASC高表达CCR9和VLA，通过CCR9／CCL25和VLA／VCAM的相互作用，促进ASC归巢到生殖道。粘膜疫苗与DNA疫苗相比，不仅影响ASC趋化因子和粘附分子的表达，而且能改变生殖道粘膜上皮细胞粘附分子的表达，有利于ASC归巢至生殖道局部。
【图文】：

PCMV4PCMV4一hC印PCMV4一hC印一C3d3图2· 2Real一 timePeR分析exeR4的转录水平 Fig2.2Real一 timePCRanalysisfortranseriPtionofCXCR4 *p<0.05eomParedtotheeontrol:#p<0.05eomparedwithpCMV4一hCGp

第二部分C3d3在DNA免疫中增加B细胞表达CXCR4及CD62L促进B细胞再循环3.C3d3促进免疫后脾脏B细胞CXCR4蛋白的表达FCM结果显示:cxCR4在各免疫组脾脏B细胞均有表达，pCMV4一hCGp和pCMV4一hCGp一C3d3组明显高于pCMV4组，而pCMV4一hCGp一C3d3组又明显高于pCMV4一hCGp组，均有显著性差异(p<0.05)。提示分子佐剂C3d3促进免疫鼠脾脏B细胞高表达CXCR4，可能有利于ASC的再循环，增强体液免疫效应。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【参考文献】

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1 王明雁,李磊,李大金,申庆祥,朱影;hCGβ-C3d融合蛋白在CHO细胞中的表达[J];上海免疫学杂志;2003年01期

2 谢黎,李昌麟,沈惠,申庆祥,王健;人绒毛膜促性腺激素β亚基和绵羊垂体促性腺激素共有α亚基组成的单链多肽的生物合成[J];实验生物学报;1998年01期

3 陈云,杨颖,刘U

本文编号：2529088