体外高甘油三酯状态下LPS对血管内皮细胞分泌功能的影响

发布时间：2019-08-28 12:54

【摘要】：目的：利用人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)原代培养的优化方法，成功构建脐静脉血管内皮细胞体外培养模型。在此基础上，以不同浓度的细菌内毒素(Lipopolyssacarides，LPS)和甘油三酯(Triglycerides，TG)共同干预受试细胞的生长，，观察作用前后不同时间段靶细胞分泌肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)和内皮素(Endothelin，ET)的变化，并确立其转录调控分子水平的依据，从始动环节部分阐明心脑血管性疾病的致病机制，为研发拮抗内毒素药物和预防心脑血管疾病提供理论基础与实验依据。 方法：1．分别比较不同浓度的胰蛋白酶和胶原酶灌注脐静脉、灌注消化法和机械刮除法、不同pH值的培养液对细胞形态、数量等生长影响来优化细胞模型的构建，并从镜下形态观察和应用Ⅷ因子相关抗原免疫组化方法对获得细胞作出鉴定。2．原代细胞经稳定传代后取对数生长期的细胞作为受试细胞，用不同浓度的LPS和TG对受试细胞作用，在不同时间段收集细胞培养的上清液，分别应用~(125)I放射性核素标记TNF和ET的抗体，对所收集的标本进行放射免疫(RIA)定量分析，给出各组HUVEC培养液中TNF和ET含量。3．按照引物合成原则并利用相关合成软件分别设计TNF，ET引物，采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增TNF和ET的mRNA，产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，紫外透射仪上肉眼观察结果并摄影记录，同时采用凝胶分析软件测算各条带光密度值，进行分析比较。
【图文】：

图l脐静脉内皮细胞镜下观察(x100倍)图2姗因子相关抗原检测镜下观察(x400倍).2所培养细胞的VII因子相关抗原免疫组化结果检测镜下可见所培养的细胞浆内呈现核周密集的棕色颗粒(见图2箭头所指处)，对照细胞内则未有这种着色现象，据此鉴定，符合内皮细胞的珊因子相关抗原免疫组化特征表现。.3不同酶消化HUVEC结果比较分别用0.125%胰蛋白酶、.025%胰蛋白酶、0.1%胶原酶三种酶消化HUVEC，在不同的消化时间进行细胞计数，结果见表l。

共同作用24h后的受试细胞，以SVtotalRNAisolationsystem试剂盒提取总RNA，后经紫外分光光度仪测定，0D26夕OD28。比值为2:1。凝胶电泳结果可见185和285两条条带清晰(见图3)，说明各组提取的总RNA样品未降解。可进行Rl斗PCR反应。285一一一.知185一一一一卜LallC1234图3不同浓度TG和ul留mLlPs共同作用24h后的受试细胞总RNA凝胶电泳图Lanel一4分别为ommolL/，lmmol几、smmol几、Iommo比TG组翼4显示，2一6号各组处均出现了一条46b4p大小的特异条带，该条带与GADPH引物所扩增产物的大小一致，即各组细胞均检测到了看家基因GADPH的扩增条带，表明本次试验条件稳定、可信度高。与Makrer比对，2一6号各组均检测到352bp另一特异性条带
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R363

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本文编号：2530153