噬菌体展示技术对免疫球蛋白结合分子结构与功能的系列研究

发布时间：2019-09-02 11:28

【摘要】： 目的:构建由噬菌体展示的免疫球蛋白结合蛋白Protein A的定点随机突变体组合文库,并应用各种类型免疫球蛋白对该组合文库进行体外亲和筛选,以获得各种具有不同结合特性的新的Ig结合分子结构,同时也为研究Ig与Ig结合分子相互作用的分子机制打下基础。 方法:应用Overlap PCR的方法制备Protein A的Z结构域(Protein A-Z),克隆于pMD-18T载体构建PA-Z/pMD-18T重组质粒。并应用含随机核苷酸序列(NNS)的引物,通过Overlap PCR方法制备对Protein A-Z的第10、13、27、28、31和32位氨基酸进行随机突变的定点随机突变体片段。在突变体片段的3′端引入3个氨基酸大小(NNS)的随机连接肽,将片段随机连接,克隆于噬菌粒展示载体pCANTAB5S,转化大肠杆菌TG1后辅助噬菌体M13K07拯救,构建由噬菌体展示的Protein A-Z定点随机突变体组合文库。测定库容量、滴度,挑取单克隆进行序列测定,评价文库的随机性。应用人IgG、IgA分别对该噬菌体文库进行4轮体外亲和筛选,结合实验监测筛选亲和力的变化,PCR法监测筛选过程中各不同数目结构域组成的变化。 结果:获得了库容量为2.4×107,滴度为1.4×1012 TU/ml的噬菌体展示Protein A-Z定点随机突变体组合文库,经测定该库在一级结构上具有较好的随机性和多样性。但在IgG、IgA亲和筛选过程中未获得阳性结合分子。 结论:对Protein A-Z的6位氨基酸随机突变并引入3个氨基酸大小随机连接肽,理论上包含的分子数目达到1010以上,为获得各种不同的免疫球蛋白结合分子,需要更大容量的噬菌体展示文库。但本实验的设计是对获得各种新型高特异性高亲和力Ig结合分子的一次科学的探索,同时也为噬菌体展示技术在免疫球蛋白结合分子进化研究中的应用提供了新的可借鉴方法。
【图文】：

如上进化筛选过程重复 4 轮。.2.3 各代噬菌体文库的滴度及无菌测定 具体方法与原代文库的滴度及无菌测定.2.4 PCR 检测各代噬菌体文库中不同大小展示片段的分布情况 具体方法与原大小展示片段的 PCR 检测相同。3、实 验 结 果.1 噬菌体展示 Protein A 定点随机突变体组合文库的构建.1. 1 PA-Z/pMD-18T 重组质粒的构建 应用 Overlap PCR 方法成功扩增 Protein A，大小为 174bp，电泳检测显示与理论值相符（图 1-3,1-4）。将扩增片段回收后MD-18T 载体, 构建 PA-Z /pMD-18T 重组质粒。1 2 3 M 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6

菌体文库的构建 突变体片段和 pCANTAB5S 为 183bp，电泳检测显示与理论值相符(图 1-6)细胞 E.coli TG1， M13K07 辅助噬菌体拯救，化数即库容量为 2.4×107，，滴度为 1.4×1012TU 1-5 PCR 扩增制备含酶切位点和随机连接肽序列的 PA-Z 突-5: PA-Z 突变体片段 (269bp) ; 6: PA-Z 片段(174bp); M: DL2000 M 1 2 3 41: PA-Z 突变体片2: PA-Z 突变体片3: pCANTAB5S4: pCANTAB5SM: DL2000 DNA
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R392

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1 周霞;噬菌体展示技术对免疫球蛋白结合分子结构与功能的系列研究[D];山西医科大学;2006年

2 卢海妹;免疫球蛋白结合分子定点随机突变组合噬菌体展示文库的构建[D];安徽医科大学;2007年

本文编号：2530905