幽门螺杆菌CagA基因克隆及表达

发布时间：2019-09-25 15:22

【摘要】：背景与目的：幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)是慢性胃炎和消化性溃疡的重要病原菌，并与胃癌和胃粘膜相关性淋巴瘤的发生密切相关。根据Hp是否含有细胞毒素相关蛋白编码基因(cytotoxin-associated protein gene A，CagA)和空泡毒素相关蛋白编码基因(Vacuolating cytotoxin-associated protein gene A，VagA)将Hp分为Ⅰ型菌株(CagA~+、VagA~+)和Ⅱ型菌株(CagA~-、VagA~-)两种。Ⅰ型菌株含有一个约40kb的特殊基因片段，因其编码CagA等毒力因子而被称为cag毒力岛。1997年到1998年，2个Hp Ⅰ型菌株26695菌株和J99菌株的基因组被完全测序，使人们能够全面了解Hp Ⅰ型菌株的基因组结构和主要特征。鉴于Ⅰ型菌株现被认为是消化道溃疡和胃肿瘤的重要成因，因此CagA基因的研究成为Hp研究中的热点。目前，对于治疗Hp感染主要应用抗生素和质子泵抑制剂，但抗生素的广泛应用会导致Hp耐药性的不断增加，且价格昂贵，复发的机率较大。因此，预防Hp的感染十分必要和紧迫。但目前尚未研制出实用有效的Hp Ⅰ型菌株疫苗。为此，本研究拟利用分子生物学技术，建立CagA的原核表达系统，为Hp重组疫苗的研制提供备选抗原，同时也为Hp Ⅰ型菌株的鉴定试剂盒提供抗原参考。 方法：根据GenBank收录的Hp CagA序列，设计PCR引物，并在每条引物前分别添加内切酶位点。通过PCR扩增Hp菌株的CagA基因，运用分子克隆的经典方法，用pGEM-T Easy载体携带该基因转化工程菌JM109，继而通过蓝白实验筛选出阳性菌落并对该基因进行测序，将其结果与已公布的CagA基因序列比对。测序结果正确后再将CagA基因从pGEM-T Easy-CagA质粒中切出，用表达载体pGEX-5X-1携带该基因转化宿主菌BL21(DE3)，通过氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR挑选出阳性克隆pGEX-5X-1-CagA。而后以IPTG诱导含pGEX-5X-1-CagA的宿
【图文】：

笱?005届硕士学位论文幽门螺杆菌CgaA基因克隆及表达物，大小均与预期的一致。琼脂糖凝胶电泳结果见图5。ZD00bP1000了55025DbP100bP图5重组pGE-xsx·1一cgaAPcR产物的琼脂糖凝胶电泳结果1一5:待检侧pGE-xs-x1一caAg为模板的PcR产物;M:MarkerFigsScerenofereombinantPGEM一SX小CagAbyPCRC(lClZ)Lanel一5:PositvieereombniantPGEM一S-Xl一CagALaneM:DNAmar骊rDL20004重组pGEX一x5一1一Ca妞酶切的鉴定结果:对经PCR鉴定正确后的pGEX一SX一1一CagA做EeoRI、Hindlll酶切，并以标准CagA基因及线状pGEX一SX几作对照进行鉴定，酶切产物均与对照位置相同，证明成功构建pGEX一SX一l一CagA。琼脂糖凝胶电泳结果见图6。123M250bP100bP图6酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳结果1:标准CgaA基因;:2线状pGE-xs-x1;:3pGE-xs-x1一CaAg酶切后;M:MarkerFig6IdentificationofPGE-XS-Xl一CagAdigestedbyendonueleaseLanel:CagAgeneLaneZ:Plas而dPGE-XSX一1Lane3:PGE-XS-X1一CagAIEeoRI，HindlllLaneM:DNAmarkerDL20M)I5重组目的融合蛋白的表达与鉴定:5.1SDS一APGE电泳结果:对经工PTG诱导表达(h6时表达量最多)，菌裂解产物做质量分数为12%的SDS~PAGE电泳后考马斯亮蓝染色观察，可见在约48KD处有一明显的诱导蛋白条

5.2Western一blot结果:诱导pGEX一sx一1一CagA重组菌表达后，western一blot结果中可见在相对分子量约48KD条带处均出现特异性显色反应(见图8)。说明重组表达的融合蛋白具有CagA抗原性，确为CagA的融合蛋白。图8、Vestern一blot1:融合蛋白;M:MarkerFigs:theersultofw七stern一blotLanel:ufsionPorteinLaneM:Porteinmarker
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R378

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本文编号：2541507