MICA-NKG2D相互作用活化γδT细胞的机制研究

发布时间：2019-10-09 15:21

【摘要】：受体NKG2D属C型凝集素家族跨膜蛋白，广泛表达在NK细胞、CD8~+的αβT细胞和γδT细胞表面。MHC-I类链相关分子A(MHC class I chain-related molecules A, MICA)是人类NKG2D识别的配体之一，应激性表达在一些肿瘤细胞或病原体感染细胞的表面，MICA的可溶性表达可能是导致这些肿瘤细胞“免疫逃逸”的重要原因之一。NKG2D-配体(NKG2DL)产生的活化信号既能直接活化NK细胞，又能以协同刺激的方式促进CD8~+αβT胞的活化。然而，NKG2DL刺激γδT细胞活化的方式目前存在争议。人类γδT细胞主要包括两个亚群：分布在外周血中的Vγ9／δ2T细胞和分布于粘膜上皮组织的Vδ1T细胞，Vγ9／δ2T细胞抗原识别受体(T cell receptor, TCR)可识别小分子磷酸化抗原，Vδ1TCR可识别应激性分子MICA／MICB。 为了研究MICA-NKG2D相互作用在Vγ9／δ2T细胞和Vδ1T细胞活化和效应中的作用机制，我们进行了以下研究：1、从人类外周血中成功克隆了NKG2D的cDNA，并利用pET原核表达系统表达了人NKG2D分子胞外区(80～216氨基酸)的重组蛋白，经纯化复性后获得了高纯度的人rNKG2D蛋白。2、用杂交瘤技术制备rNKG2D分子的单克隆抗体。3、用固相化anti-pan-γδTCR单抗扩增人PBMC，得到纯度达90％以上Vγ9／δ2T细胞；用固相化rMICA蛋白扩增卵巢癌(OEC)患者肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，获得纯度为68％的Vδ1T细胞。4、检测anti-NKG2D单抗或rMICA蛋白封闭前后，vγ9／δ2T细胞和Vδ1T细胞对Daudi、HCT-116和HT-29肿瘤细胞的杀伤活性。在效靶比10：1时，anti-NKG2D单抗对Vγ9／δ2T细胞杀伤HCT-116和HT-29细胞的阻断率分别为20％和10％，而rMICA蛋白的阻断效率分别为12％和5％；在相同效靶比下，anti-NKG2D单抗对Vδ1T细胞杀伤HCT-116和HT-29细胞的阻断率分别为42％和35％，rMICA蛋白的阻断率分别为18％和20％。5、构建表达不同形式MICA分子和eGFP融合蛋白的真核表达体系，瞬时转染MICA~-的CHO细胞和Daudi细胞，检测γδT细胞对表达不同形式MICA分子靶细胞的杀伤效率。
【图文】：

.7BL21(DE3)IPET22b一NKGZD表达产物的SDS一EanalysisofexPerssionPorduCtsofBL21(DE3)IPEd:LnaeZ:PereiPiatte，uninduced:Lnae4:10wmolecolL/尿素变性后，经HisTarpkit亲和柱纯果如图1.8所示，获得较高纯度的目的蛋白单克隆抗体(克隆号为1D11)为一抗，以H体反应，再于暗室中经压片、曝光、显色后，，如图1.9所示，叭触setm一blot结果证实原抗IDll结合。

sPuenraatnt，induced.包涵体经smolL/尿素变性后，经HisTarpkit亲和柱纯化后，透析复性，SDS一APGE鉴定结果如图1.8所示，获得较高纯度的目的蛋白。电泳后转膜，以市售的抗NKGZD单克隆抗体(克隆号为1D11)为一抗，以HRP一羊抗鼠gIG为二抗，进行抗原抗体反应，，再于暗室中经压片、曝光、显色后，在目的蛋白对应分子量处出现条带，如图1.9所示，叭触setm一blot结果证实原核表达的NrKGZD蛋白能与特异性单抗IDll结合。图1.8重组NKGZO蛋白纯化产物的505一APGE分析
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R392

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1 李建强;MICA-NKG2D相互作用活化γδT细胞的机制研究[D];中国协和医科大学;2006年

本文编号：2546847