HCVp7蛋白反式调节基因p7TP2生物学功能的研究

发布时间：2019-10-11 10:03

【摘要】： 目前世界上有1.7亿人感染丙型肝炎病毒,危害严重,但目前还没有特效的治疗技术和方法。找出肝细胞中与HCV反式调节相关的基因,并进一步弄清具体作用机制、作用效应及连带影响,对明确HCV的致病机理,寻找有效防治方法有重要意义。HCV p7TP2是利用基因芯片筛选的HCV p7蛋白下调表达的靶基因,其许多功能仍需要进一步研究。本试验主要应用酵母双杂交技术、抑制性消减杂交技术、原核表达技术、实时荧光定量PCR等方法研究p7TP2基因的生物学功能。 1.以HepG2细胞cDNA为模板克隆出p7TP2基因,编码区为495bp (核苷酸),应用生物信息学分析此基因位于8q24.3,半衰期为30h,属于不稳定蛋白,疏水指数较高,预测可能为具有不紧密的球蛋白结构,具有信号肽及两个跨膜结构域。 2.应用实时荧光定量PCR验证HCV p7蛋白下调p7TP2基因的表达,并应用抑制性消减杂交筛选并构建p7TP2下调表达基因的消减文库,同源性分析p7TP2下调表达的基因主要位于线粒体,并与调控细胞增殖、分化、凋亡的信号传导通路有关。 3.利用原核表达系统,构建融合表达载体,IPTG诱导表达融合蛋白,证明其相对分子量约为33000,纯化融合蛋白,并免疫兔子,制备多克隆抗体,经酶联免疫吸附测定、蛋白质免疫印迹,此抗体具有较高效价和特异性。 4.免疫组织化学检测p7TP2蛋白在阳性组织中分布在细胞浆,且在正常组织的表达量比病理组织高。构建绿色荧光蛋白GFP与p7TP2的融合基因,转入不同的细胞系HepG2及COS-7,荧光显微镜观察其亚细胞定位,显示荧光主要集中在细胞浆。 5.应用酵母双杂交系统,构建诱饵质粒pGBKT7-p7TP2,转化酵母细胞AH109,并与转化人肝细胞文库质粒的酵母细胞Y187配合,在营养缺陷型培养基和X-α-gal上进行双重筛选,测序,并进行生物信息学分析。结果显示p7TP2蛋白与一些直接和间接与抗凝血因子有关的蛋白基因具有相互作用,推测p7TP2蛋白可能直接或间接参与抗凝血过程。 6.选取p7TP2基因起始密码子ATG上游1203bp下游147bp的基因组DNA序列作为启动子,克隆并构建载体pCAT3-p7TP2-p和PGLB-p7TP2-p,应用CAT表达系统和双荧光素酶系统检测显示在不同的细胞系HepG2和Huh-7中均具有启动子活性;共转染试验显示HCV p7对p7TP2启动子活性具有下调作用。 上述结论为进一步研究p7TP2基因的结构和功能提供了新的线索,也为HCV p7的反式调节作用及HCV发病机制研究奠定了基础。
【图文】：

进行 PROF 预测，并预测可能为球蛋白，但结构并不是特别紧密。疏水性预测最大值是 2.422，最小值是-2.289，在 8～32，100～118，基酸具有很强的疏水性，其次是 84～95 的区域具有一定的疏水性(图gnalP-信号肽预测工具预测该蛋白信号肽概率 0.991，，锚定蛋白概率点概率是 0.471，位于 27 与 28 氨基酸之间(图 2-7)。进行跨膜结构的分析包括两个强跨膜螺旋(从 11~27，跨膜方向由跨膜方向由外向内)(图 2-8)，无明显的卷曲螺旋结构。1 MVEVPRHHPC CLLMALGWVL PSWGSLGAVG SPESAWRRWR FGEFGRQAGV51 SCRGPGKGDC DSGSSRAKAx xxxxxxxxxx xTPAHCTLRF QLPGAGEMAE101 PGPWMISVPV PLFPGxxxxx xxxxxxxxWR NTGPNRGCGS KTHTRTRPGA151 ALCSSGPWLG LVVM图 2-5 x 代表低复杂性区域Fig.2-5 x represents low reproducibility regions

图 2-7 p7TP2 蛋白的信号肽分析Fig.2-7 the signal peptide analysis of p7TP2 protein图 2-8 p7TP2 蛋白的跨膜结构域分析Fig.2-8 the transmembrane structural domain analysis of p7TP2 protein
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R346

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本文编号：2547428