人LC3B-β的鉴定及其对LC3B-α的负反馈调节机制

发布时间：2019-10-11 22:06

【摘要】：大鼠微管相关蛋白1轻链3(LC3)经过一系列翻译后修饰，最后定位到自噬体膜上，目前已经作为自噬体的分子标记广泛应用于自噬过程和与之相关的许多生理，病理过程的研究中。我们以前报道了3个人LC3家族的新成员，LC3A，LC3B和LC3C。LC3A和LC3C与酵母Atg8和大鼠LC3相类似，经历了一系列的翻译后修饰，包括羧基末端的切割；但LC3B羧基末端不被切割，产生了一种不同于大鼠LC3的依赖于羧基末端未被切割的赖氨酸(Lys122)的新的翻译后修饰方式。最近日本学者报道人LC3B的羧基末端也能被切割，并进一步在Gly120产生修饰，与大鼠LC3类似。 为了阐述清楚这个问题，我们首先证明人LC3B由于可变剪接产生了两种亚型，LC3B-α和LC3B-β，分别具有或缺失Arg70。LC3B-α和LC3B-β在人的多种组织中都广泛表达。LC3B-α发生了典型的羧基末端切割反应，而且定位到自噬体膜上；LC3B-β不能。当LC3B-α的Gly120突变时，其羧基末端不能切割，此时LC3B-α的电泳行为与LC3B-β相同，且都受Lys122／121的影响。通过质谱分析，我们发现尽管LC3B-β和LC3B-β-K121A在电泳上表现为相差2KD，但它们的分子量几乎相同，也就是说LC3B-β上没有发生修饰。我们还对LC3B-α和LC3B-β的结构进行同源模拟，结果表明LC3B-α和LC3B-β的羧基末端具有不同的结构：LC3B-α的羧基末端游离于其蛋白主体之外，不停的运动；而LC3B-β的羧基末端与其蛋白主体紧密结合在一起，是固定不动的，，进一步从结构水平上解释了为什么LC3B-α和LC3B-β的羧基末端具有不同的切割反应。GST pull-down实验证明ATG4B与LC3B-α和LC3B-β都能相互作用，而且ATG4B能在体外切割LC3B-α的羧基末端。将LC3B-α和LC3B-β同时转染细胞，发现LC3B-β能抑制LC3B-α羧基末端的切割，并影响LC3B-α的修饰和自噬体膜定位，提示LC3B-β在体内可能具有负调节自噬体形成的功能。 此外，本文还对本实验室以前克隆的大鼠LC3A和LC3B的翻译后修饰方式进行了进一步的研究。发现大鼠LC3A和LC3B经过了与大鼠LC3相同的翻译后羧基末端切割和修饰反应，并且都能定位到自噬体膜上。而且羧基末端保守的甘氨酸 (Gly120)是大鼠LC3A和LC3B翻译后羧基末端切割和修饰，以及自噬体膜定位所必须的。因此我们认为大鼠LC3A和LC3B能作为新的自噬体分子标记，广泛应用于对自噬过程以及与之相关的生理和病理过程的研究之中。
【图文】：

复旦大学博士论文第一章人LC3B一p的鉴定及其对LC3B一a的负反馈调节机制R68An一noncidsMl167Pr心·砚、tR秘AS’一AUG-一AUU一APos且t一onoth几一月”a艺一el一rI685.993j一guaaU-一aaUag-卜一.Intron4一祠38885R69R7O人一AGG一CGC一V125一GUG一UA八3994.029R68Anlinoae鑫dsI，re·n一RNA5‘·AUG一“一AUU一AG·guaau-，二aauag·A一AG‘卜一一一Intron4‘一月R69V124一CGC一、·GUG。UAA一:PO，.11。一、合一hu.”“n‘hrl635.99338885，994032图1.人LC3B基因第4个内含子的3’末端发生可变剪接.(A)LC3B一a剪接形式具有3个连续的精氨酸残基R68，R69，和R70.(B)LC3B一p剪接形式只有两个连续的精氨酸残基，相对应于其氨基酸序列，编号为R68，R69，缺少R70.L哪Ba

图3.艺乙朋、和乙之议了问钓组织表达谱.(A)乙‘召刀艰不}以艺J刀节在18种人组织cDNA和2种人gtlo门1cONA(以“*”标记)文库中的表达情况.(B)乙￡万口渭在18种人组织种相对于乙乙扮公的表达卜度(LC3B一p/LC3B一a).接着我们以人肝gtlo/11eD、A文库为模板扩增LCB戍尺产物直接测序，结果证实产物是LC3B一a和LC3B一日的编码区(O尺F)，将的混合物(图4)。.﨑CAT仁C几G，.宁人C.C^‘T七Te甲.C6G决CAG.臼GLc，B‘几血GA下AA，T几
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R341

【共引文献】

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本文编号：2547698