新型抗CD3小分子抗体的设计及其功能研究

发布时间：2019-10-29 02:17

【摘要】： 抗CD3单克隆抗体OKT3自1986年被FDA批准用于临床以来，在肾、心脏、骨髓等实体及非实体器官移植后的抗排斥反应中有着广泛的应用，近年来在Ⅰ型糖尿病等自身免疫病的治疗中也取得了良好的临床疗效。但是抗CD3抗体与Fc受体相互作用引起的丝裂原活性以及鼠抗体的免疫原性给抗体的临床应用带来严重的毒副作用。目前，国内外学者分别通过抗体人源化以及对抗体中参与与Fc受体相互作用的位点进行点突变来降低抗体的免疫原性和丝裂原活性，国外已有相应的产品进入各期临床试验，取得很好的临床效果。因此，研制具有自主知识产权的新型无丝裂原活性的抗CD3抗体具有重要的理论和实际意义。 本论文在本室保存的抗CD3鼠源性单抗yCD3的基础上，借助本实验室建立的“基于抗原—抗体相互作用结构信息设计新型结构抗体分子”技术平台，设计了新型的无丝裂原活性的抗CD3小分子抗体mini-yCD3，同时实现了抗体的部分人源化，并且对新型抗体的功能及作用机理进行了初步探讨。具体研究结果如下： 1、钓取了抗CD3鼠源性单抗yCD3的重轻链抗体基因，构建表达了抗CD3嵌合抗体，对抗体的功能进行了初步鉴定。所构建的抗CD3嵌合抗体可以与CD3~+细胞系Jurkat以及外周血单个核细胞PBMC特异性结合。在混合淋巴细胞培养中显示了良好的免疫抑制活性。 2、借助“基于抗原—抗体相互作用结构信息设计新型结构抗体分子”技术平台，，优化设计了新型小分子抗体mini-yCD3，其结构模式为VH—Linker—VL—hinge—Human IgG1 CH_3 domain。利用距离几何学、计算机图形学技术对绞链区进行分析改造，使两条mini-yCD3单链结构通过绞链区的二硫键形成稳定的双价结构。理论数据显示，该小分子抗体可以与两个CD3抗原结合，其作用模式与亲本抗体相似。 3、通过在CHO细胞中的稳定表达，获得了小分子抗体mini-yCD3，在体外对该抗体的功能进行了验证。结果与理论预测一致，该新型抗体在非还原条件下以二聚体形式存在，保持了与亲本抗体一致的亲和力、免疫抑制活性以及下调T细胞表面CD3分子表达水平的能力；同时新型抗体没有明显地引起T细胞的活化，也未引起明显的IL-2、IFN-γ等炎性细胞因子的释放。也就是说，设计的新型小分子抗体mini-yCD3呈天然双价结构，保持了亲本抗体的亲和力和免疫抑制活性，大大的降低了抗体的丝裂原活性。 4、选择T细胞活化途径中的几个关键环节：CD3分子ζ链的磷酸化以及Zap70的募集、细胞内钙离子浓度的变化和NFAT入核等，对新型小分子抗体与亲本抗体介导T细胞活化信号的差异进行分析，初步探讨了不同结构抗体介导T细胞不同活性的分子机制。鼠单抗yCD3的刺激可以引起CD3ζ链的充分磷酸化，而在小分子抗体mini-yCD3作用后，CD3ζ链的磷酸化水平仅维持在一个较低的水平。经yCD3充分激活的CD3ζ链可以有效地引起ZAP70的募集活化、细胞内钙离子浓度的升高、NFAT的入核以及IL-2的表达，最后导致T细胞的完全活化；而小分子抗体mini-yCD3虽然在高浓度作用下可以提高一定的细胞内钙离子浓度，但是不足以激活后续的通路，因此不能完全活化T细胞。
【图文】：

博士论文前一言前言CD3分子广泛分布于T细胞和胸腺细胞表面，有五种亚基:丫，6，。，屯和n，在8小90%T细胞中以今Y一。一6一屯弋的形式存在，另1小20%T细胞中则以。一丫一卜6一屯的形式存在。eo3分子与T细胞受体(theTeellreeeptor，TCR)组成TCR/CD复合物，参与T细胞识别抗原并转导T细胞识别抗原后的刺激信号，在T细胞介的免疫反应中起着关键作用(图l)川。Str“‘tur一ofCO3PolyP.Pt示d二’丁

图2.抗CD3抗体介导T细胞免疫抑制功能的四种可能途径抗CD3抗体在临床应用中获得良好疗效的同时，存在两个严重的毒副作用。首先是抗体的鼠源性会引起人抗小鼠反应(HAMA反应)，作为异源蛋白在人体内能迅速地被清除，严重地影响了抗体的疗效以及抗体的再次使用〔’“，’7」。目前主要通过抗体人源化、制备人源抗体等手段来减弱抗体的鼠源性，降低HAMA反应，延长半衰期。抗CD3抗体的另一个毒副作用是由其丝裂原活性引起的。在体外，它可以引起T细胞的增殖和大量细胞因子的释放(TNF，IFN一丫，IL一2，IL一3，IL一4，IL一6，IL一10等)[’“，，”]。在体内，它会引起严重的急性“流感样”综合症，伴随着大量的细胞因子释放，表现为发热、寒战、震颤、胸痛和胸闷、呼吸困难、恶心呕吐、腹泻以及血压变化等症状，较严重者会导致肺水肿，个别严重的会导致死亡120一29]。一系列的研究表明，抗CD3抗体的丝裂原活性是由于抗CD3抗体的Fc
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【共引文献】

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1 邵文雨;乙肝阳性肝移植病人外周血中HBV特异性CTL频度和急性排斥发生关系研究[D];第二军医大学;2007年

本文编号：2553321