胞外基质对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

发布时间：2019-11-27 15:59

【摘要】：骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells ,MSCs)是骨髓系统一种具有多向分化潜能的干细胞,具有极强的自我复制能力,在特定的条件下可以分化为多种中胚层和部分外胚层来源的组织和细胞(如:成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、神经细胞)。MSCs 取材方便,来源充足,自体MSCs 诱导分化后进行移植治疗,解决了异体细胞免疫排斥反应的问题。由于MSCs 具有独特的细胞增殖分裂模式,使外源基因易于导入和表达,而使其成为潜在的基因治疗靶细胞,因而MSCs 逐渐成为一种重要的组织工程种子细胞。已有报道将骨髓MSCs 诱导分化为成骨细胞、软骨细胞,并在临床上用于修复骨组织、软骨组织的缺损。然而,目前骨髓间充质干细胞分离纯化鉴定及体外培养尚没有一致方案,有些方法相当繁琐,不利于MSCs 培养的标准化及推广,而且MSCs 体外培养生长较慢,原代培养的细胞两周才能融合,传代7 代以后增殖变得缓慢,并有自动分化为成骨细胞的可能。因此如何使MSCs 在体外快速的生长增殖,得到大量的纯化的细胞就成为研究干细胞的前提和基础。研究证实:胞外基质(Extracellular matrix,ECM)是组成间质和上皮-血管中基质的不溶性结构成分,它不仅仅是细胞机械支持组织,而且是供给营养和免疫应答的场所,参与调节胚胎发育进程,决定细胞的粘附与迁移,在创伤修复和纤维化、细胞的生长、增殖、分化、代谢和肿瘤发生及转移中起重要作用。基于此,本实验对成体大鼠的骨髓MSCs 进行了体外分离、培养和初步的组织化学检测,并用胞外基质(胶原I、弹性蛋白)对其进行刺激,检测增殖基因c-fos 的表达情况。力求寻找一个在体外促使MSCs 增殖的最佳胞外基质刺激条件,为其应用提供基础实验依据。方法: 本实验采用1.073g/mL Percoll 细胞分离液密度梯度离心与贴壁培养相结合的方法,体外培养大鼠骨髓间充质干细胞。3 天后首次换液,以后每4 天换液。待细胞融合后,消化传代,使之逐渐纯化。研究了其在体外传代培养中的HE 染色、生长曲线、细胞周期等生物学特点。免疫组化方法检测表面抗原CD34、CD44、胶原I(Collagen I) 、Fibronectin 的表达。用细胞诱导液(10 mmol/L β-甘油磷酸钠,10~(-8) mmol/L 地塞米松,50 μg/mL 抗坏血酸)诱导其向成骨分化,并用改良的Gomori钙钴法检测碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)的表达来间接验证分离获得的MSCs 是否具有多向分化的能力。在此基础上,用胞外基质(Collagen I 、弹性蛋白)刺激MSCs,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况。刺激后,提取细胞总mRNA,用RT-PCR 检测其增殖基因c-fos 的表达情况。
【图文】：

均匀分布,刚接,细胞

庆大学硕士学位论文 2 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养细胞（每个视野约 1-10 个），大小较均一，其核浆分界清楚，折光性强，，核绝大数为单核、圆形，位于细胞中央（如图 2.2）。48-72h 后可以观察到贴壁的细胞部分呈纤维状，也有少量的为宽阔的平坦的三角状、星状等。未贴壁的细胞在液过程中被除去。接种 5-7 天，可见明显的集落形成（如图 2.3）。集落中的细胞断扩增，呈反射状、漩涡状向周围扩增，逐渐与临近集落融合形成单层。此期细胞生长迅速，大约两周原代培养的细胞相互融合可达到 85％的生长表面（如 2.4）。传代培养后，细胞变为圆形，核透亮（如图 2.5），接种后 6-8h 开始贴壁，4h 之内绝大部分细胞贴壁且成纤维状，梭形，但是成均匀分布生长。更换培养基未贴壁的造血细胞排除，约 4-7 天传代的细胞达到 90％融合，经传代培养后细的形态更加趋于一致。

大鼠,集落

大鼠MSCs形成集落100×Fig.2.3CFU-FofratMSCs100×
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R329.2

【参考文献】