弓形虫RH株速殖子cDNA文库的构建、免疫学筛选及阳性克隆鉴定

发布时间：2019-11-28 23:49

【摘要】：目的:构建弓形虫RH株速殖子cDNA文库并用慢性感染的小鼠血清对其进行免疫学筛选,以寻找有效的疫苗候选分子和早期诊断弓形虫病的试剂。方法:收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取总RNA,逆转录生成cDNA,PCR合成cDNA双链。经过纯化、sfi A B酶切、过柱除去小片段后,与λTriplEx2噬菌体载体两臂连接包装后形成弓形虫RH株速殖子cDNA文库。收集成囊株(Pruaniaud株)慢性感染的小鼠血清,经滤膜吸附法去除血清中的大肠杆菌抗体,用以筛选弓形虫RH株速殖子cDNA文库。对3次复筛得到的阳性克隆进行插入片段的核苷酸序列测定,结果送GenBank进行同源性分析。根据序列测定结果,选取其中一个具有完整开放阅读框架的基因进行分析。结果:初始文库的容量为7.8×10~6个重组子,经感染XLl-Blue菌扩增后,文库的滴度达10~(10)pfu/ml。任意挑取克隆经自身环化后提取质粒,酶切后片段大小范围为400-1200bp,重组率90%以上。用抗血清初筛了约7.2×10~4个重组的噬菌体,得到38个阳性克隆,对其中15个阳性克隆经过三次复筛,得到4个持续阳性反应克隆。通过对四个克隆进行测序并经同源性分析发现,WT1克隆基因为弓形虫P30基因;WT4克隆基为弓形虫N-乙酰磷酸丙糖转移酶基因;WT9克隆基因与现在已知的基因无同源性:WT12克隆基因与一未知的弓形虫基因有很高的同源性,且具有一个513bp大小的完整的开放阅读框架,通过对其蛋白质结构和功能预测,它可能是一个跨膜信号蛋白。结论:本试验成功地构建了弓形虫RH株速殖子cDNA文库,筛选所得到的阳性克隆有望成为早期诊断抗原或保护性疫苗分子,值得进一步研究。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R392

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本文编号：2567217