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结核分枝杆菌重组Bb-ESAT-6-MPT64疫苗构建及其免疫机制研究

发布时间:2019-11-29 00:12
【摘要】: 目的 构建结核分枝杆菌rBb-ESAT-6-MPT64疫苗;分析重组质粒pGEX-ESAT-6-MPT64在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达效率;通过不同途径接种疫苗,在MTB攻击后,检测实验动物血清抗体及其亚类变化脾T淋巴细胞增殖脾T细胞CD4+和CD8+亚群变化以及脾细胞凋亡情况,从而初步阐述其保护性免疫机制,为结核病的防治提供一种有价值的疫苗。 方法 以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得ESAT-6和MPT64抗原编码基因序列,然后采用序贯PCR(gene SOEing)法将ESAT-6和MPT64编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3经PCR扩增融合,定向克隆入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-ESAT-6-MPT64;用电穿孔法将该质粒导入BL21 ( DE3 )及Bb ,构建结核分枝杆菌重组Bb-ESAT-6-MPT64疫苗。 SDS-PAGE及Western blot分析pGEX-ESAT-6-MPT64在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导1~13h表达的目的蛋白。 为了研究rBb-ESAT-6-MPT64疫苗免疫BALB/c小鼠后,抗MTB攻击产生的免疫应答及其保护性免疫机制,将65只雌性BALB/c小鼠随机分为5组,每组13只。A组: rBb-ESAT-6-MPT64皮下注射;B组:rBb-ESAT-6-MPT64肌肉注射;C组:rBb-ESAT-6-MPT64鼻腔粘膜接种;D组:Bb皮下注射对照;E组:100μl PBS皮下注射对照。A、B组:5×106CFU疫苗悬浮于100μl PBS于小鼠后背部皮下单次注射及肌肉注射;C组:5×105CFU疫苗悬浮于10μl PBS于小鼠鼻腔粘膜单次接种;D组:5×106CFU Bb悬浮于100μl PBS于小鼠后背部皮下单次注射。5组均于疫苗免疫8w后用5×105CFU MTB鼻腔内攻击。在MTB攻击感染后6w,用ELISA方法检测各组鼠血清特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgE抗体水平;用MTT比色法检测脾细胞增殖水平;用FCM检测脾细胞CD4+和CD8+亚群变化及用Annexin V-FITC试剂盒检测脾细胞原液或ConA刺激培养时细胞凋亡发生率。 结果 琼脂糖凝胶电泳证实PCR扩增的ESAT-6-MPT64融合基因全长1020bp,序列分析发现其与预期结果一致;双酶切证实ESAT-6-MPT64融合基因成功插入pGEX-1λT中,成功构建能够表达目的蛋白的重组质粒pGEX-ESAT-6-MPT64;将含50μg/ml Amp的MRS琼脂平板筛选的rBb经PCR鉴定分析,证实pGEX-ESAT-6-MPT64成功转进Bb,rBb-ESAT-6-MPT64疫苗构建成功。 SDS-PAGE及Western blot分析重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导1~13h表达了60kDa的目的蛋白,占菌体总蛋白的22%,且能与人血清抗体发生特异结合。 疫苗免疫8W后用5×105CFU MTB H37Ra减毒株鼻腔内进行攻击,在H37Ra攻击感染后6w用ELISA法检测抗体结果:A~C组中,小鼠IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b水平均较对照组D、E组显著增高,IgG3和IgE水平均较对照组D、E组无显著差异;3组之间的相互比较:C组IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b水平较A、B组显著增高,C组IgG3和IgE水平均较A、B组无显著差异,A、B组之间各抗体水平无显著差异。 用MTT法检测的小鼠脾淋巴细胞增殖结果: A~C组中,小鼠脾细胞原液组、MTB刺激组或ConA刺激培养组淋巴细胞增殖指数均显著高于D、E对照组,每个ConA刺激组增殖指数显著高于相应的原液组或MTB刺激组;每个MTB刺激组增殖指数显著高于相应的原液组;在原液组中,三组之间均无显著性差异;在MTB刺激组中,C组鼻腔粘膜接种组增殖指数显著高于B组肌肉注射组,余无显著性差异;在ConA刺激组中,C组鼻腔粘膜接种组增殖指数显著高于A组皮下注射组和B组肌肉注射组,A、B组之间无显著性差异。 用FCM检测CD4+和CD8+亚群水平结果:A~C组CD8+亚群水平均较D、E对照组增加,但均无显著差异;A~C组CD4+亚群水平分别较D、E对照组有统计学意义增加;各组之间两两比较,C组CD4+亚群水平较A、B组有显著性增加,余均无统计学意义。 用Annexin V-FITC试剂盒检测小鼠脾细胞凋亡结果:A~C组中,小鼠脾细胞原液组或ConA刺激培养组细胞凋亡发生率均显著低于D、E对照组,每个ConA刺激组脾细胞凋亡发生率显著高于相应的原液组;C组鼻腔粘膜接种组脾细胞凋亡率显著低于A组皮下注射组和B组肌肉注射组;A组皮下注射组脾细胞凋亡率显著低于B组肌肉注射组。 结论 1.通过序贯PCR成功扩增出ESAT-6-MPT64融合基因。 2.成功构建结核分枝杆菌穿梭表达载体pGEX-ESAT-6-MPT64。 3.成功构建结核分枝杆菌rBb-ESAT-6-MPT64疫苗。 4.结核分枝杆菌重组质粒pGEX-ESAT-6-MPT64能在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,表达效率为22%,并且表达的重组蛋白具有特异的抗原性。 5.rBb-ESAT-6-MPT64疫苗能诱导BALB/c小鼠产生较强的特异性CD4+Th1型细胞免疫、体液免疫及微弱的CD8+CTL反应。 6.rBb-ESAT-6-MPT64疫苗鼻腔粘膜接种途径诱导BALB/c小鼠产生的保护性优于皮下注射和肌肉注射途径。
【图文】:

阴离子去污剂,去污剂,惰性,非特异性


e 1-2: ESAT-6-MPT64 PCR productLane 3: DNA MarkerIdentification of PCR product of ES-3 ESAT-6-MPT64 PCR 扩增产物鉴很多如阴离子去污剂法、苯酚抽近年来已逐渐被试剂盒所取代。有一层惰性大分子材料,能选择核酸类物质。作者在制备基因组Protein K 和去污剂裂解细菌释放简单的步骤即可除去非特异性结的 DNA。此法操作简单、经济实
【学位授予单位】:重庆医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R392

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本文编号:2567227

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