硒蛋白K对T淋巴细胞免疫应答影响的研究

发布时间：2017-03-20 06:10

  本文关键词：硒蛋白K对T淋巴细胞免疫应答影响的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：硒是一种人类和动物必需的微量元素,与许多疾病密切相关,如癌症、神经退行性疾病及心血管病等,并在一些重大疾病的防治中起到重要作用。硒在生物体内主要以遗传密码子UGA编码的第21种氨基酸--硒代半胱氨酸(Sec)的形式存在于蛋白质内,通过各种硒蛋白发挥生物功能。目前在人类基因组中已经发现了25种硒蛋白,但研究较清楚的仅有谷胱甘肽过氧化物酶等少数硒蛋白。硒蛋白K(Sel K)是2003年被Gladyshv实验室鉴定出的一种新型硒蛋白,发现早期关于Sel K的生物学功能一直研究甚少,直到近几年才有了一些研究进展。研究表明Sel K可能有如下功能:Sel K在心肌细胞中参与应对氧化应激;在人肝癌细胞中参与调节内质网应激;参与内质网相关蛋白降解;参与免疫调节;参与调节巨噬细胞表面CD36棕榈酰化,影响泡沫细胞的形成和动脉粥样化。探究Sel K生物学功能、了解Sel K与疾病的关系具有重要的意义和应用价值。蛋白质的组织差异表达和细胞内定位与其生物学功能存在一定的相关性。为了解Sel K在哺乳动物各组织中的差异表达情况,本研究采用BALB/c小鼠作为研究对象,取新鲜组织脾脏、肾脏、肠、肺、脑和肝脏,通过Real time-PCR和Western blot分别检测Sel K在m RNA和蛋白水平上的组织差异表达情况,结果显示Sel K在脾脏中的表达明显高于其他组织。制作小鼠脾脏组织的石蜡切片,通过免疫组织化学染色的方法,验证了Sel K在脾脏中的高表达,并且实验结果显示出Sel K围绕在细胞核周围。采用细胞免疫荧光的方法进一步研究Sel K在小鼠T淋巴细胞内的位置,用Alexa Fluor#174;488绿色荧光标记KDEL(内质网标记物),同时用TRITC红色荧光标记Sel K,结果显示这两种荧光重合,因此表明Sel K与KDEL定位在同一位置即内质网。为进一步研究Sel K在细胞免疫中所起的作用,本研究构建了用于干扰Sel K表达的干扰载体(p GPU-Sel K-mus-222、p GPU-Sel K-mus-102和p GPU-Sel K-mus-101),成功转染小鼠T淋巴细胞,选择干扰效率最佳的p GPU-Sel K-mus-101载体进行后续实验。CD3体外激活干扰组和对照组T细胞,检测细胞内与增殖分化相关的指标变化(Ca~(2+)、IL-2Rα、IL-4)。结果表明激活后的干扰组T细胞中钙离子浓度上升趋势较弱与对照组有显著性差异,即说明Sel K的减少影响了细胞活化过程中细胞内Ca~(2+)浓度的升高,进一步研究表明Sel K干扰对细胞内内质网钙稳态蛋白(CHERP)的表达有抑制作用,说明Sel K有可能通过CHERP来调节细胞活化过程中的钙流。采用Real time-PCR检测IL-2Rα的表达情况,结果显示激活后的对照组细胞中IL-2Rα的m RNA水平显著上升,而激活前后的干扰组细胞中IL-2Rα的m RNA水平无显著变化,同样说明Sel K的减少影响了细胞活化过程中IL-2Rα的表达。采用ELISA方法检测细胞培养物上清中细胞因子(IL-4)的分泌情况,结果显示与对照组相比,干扰组细胞上清液中IL-4的分泌显著下降。这些结果表明Sel K可能在TCR活化诱导的小鼠T淋巴细胞增殖分化过程具有重要的作用。硒代蛋氨酸常用来体外处理细胞以达到补硒的效果,我们用不同浓度(1μM,3μM,5μM,10μM,50μM,100μM)的硒代蛋氨酸体外处理T淋巴细胞,CCK-8检测发现硒代蛋氨酸对T淋巴细胞变现出“低促高抑”的现象,5μM硒代蛋氨酸处理T淋巴细胞24小时可以表现出最佳的增殖效果。Real time-PCR检测硒代蛋氨酸对T淋巴细胞内Sel K表达的影响,结果发现加硒处理组细胞中Sel K的表达显著升高,以上结果提示适量补硒会提高Sel K的表达并且促进T淋巴细胞增殖,或因此提高机体免疫能力。以上结果表明Sel K是一种在脾脏高表达的内质网蛋白,Sel K干扰抑制了CHERP的表达,或因此影响到细胞活化过程中的钙离子浓度的升高,从而阻碍了下游的信号转导,如IL-2Rα的表达、IL-4的分泌等。此外适量浓度的硒代蛋氨酸可以提高T淋巴细胞中Sel K的表达,并且可以促进细胞增殖,或因此提高机体免疫能力。
【关键词】：硒蛋白K T淋巴细胞 体外干扰 免疫应答 硒代蛋氨酸
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 前言12-21
• 1.1 硒与硒蛋白12-16
• 1.1.1 硒12
• 1.1.2 硒蛋白12-16
• 1.2 SelK16-19
• 1.2.1 SelK的结构特征16
• 1.2.2 SelK的细胞内定位与组织分布16-17
• 1.2.3 SelK的生物学功能研究进展17-19
• 1.3 T细胞活化的信号转导途径19-20
• 1.4 RNA干扰技术20
• 1.5 论文的选题与意义20-21
• 第2章 材料与方法21-45
• 2.1 实验材料21-26
• 2.1.1 小鼠21
• 2.1.2 细胞株21
• 2.1.3 大肠杆菌菌株21
• 2.1.4 质粒21-22
• 2.1.5 引物22
• 2.1.6 主要试剂和试剂盒22-24
• 2.1.7 实验主要试剂的配制24-25
• 2.1.8 实验主要仪器25-26
• 2.2 实验方法26-45
• 2.2.1 Real time-PCR检测SelK、IL-2Rα 和CHERP基因在mRNA水平上的表达26-29
• 2.2.2 Western blot检测相关蛋白表达水平29-32
• 2.2.3 免疫组化检测各组织中Sel K的表达与分布32-35
• 2.2.4 T淋巴细胞的培养35-36
• 2.2.5 细胞免疫荧光检测Sel K在T淋巴细胞中的定位36-37
• 2.2.6 shRNA载体的构建与鉴定37-41
• 2.2.7 细胞转染41-43
• 2.2.8 流式细胞术检测钙流43
• 2.2.9 ELISA检测细胞因子43-44
• 2.2.10 CCK-8 检测细胞增殖情况44-45
• 第3章 实验结果45-64
• 3.1 SelK在小鼠中的组织分布45-48
• 3.1.1 SelK在小鼠组织中mRNA水平上的差异45-47
• 3.1.2 SelK在小鼠各组织中蛋白水平上的表达差异47-48
• 3.2 SelK的细胞内定位48-49
• 3.2.1 免疫组化检测Sel K在小鼠脾脏中的分布48-49
• 3.2.2 细胞免疫荧光结果49
• 3.3 干扰质粒的构建与鉴定49-50
• 3.3.1 干扰质粒的双酶切鉴定49-50
• 3.3.2 重组质粒的测序鉴定结果50
• 3.4 体外干扰Sel K对T淋巴细胞的影响50-61
• 3.4.1 shRNA体外干扰小鼠T淋巴细胞SelK的表达50-53
• 3.4.2 SelK干扰对T淋巴细胞中钙流的影响53-56
• 3.4.3 SelK干扰对细胞内CHERP的影响56-57
• 3.4.4 SelK干扰对细胞内IL-2R的影响57-59
• 3.4.5 SelK缺乏对T淋巴细胞中细胞因子的影响59-61
• 3.5 体外加硒对T淋巴细胞增殖以及SelK表达的影响61-64
• 3.5.1 硒代蛋氨酸对T淋巴细胞增殖的影响61-62
• 3.5.2 硒代蛋氨酸对T淋巴细胞中SelK表达的影响62-64
• 第4章 讨论64-67
• 第5章 结论67-68
• 参考文献68-73
• 附录73-77
• 致谢77-78
• 攻读硕士期间的研究成果78-79

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 田金可;吴秋珏;王恬;;硒的抗氧化功能及在动物生产中的应用[J];中国饲料;2011年23期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 李静;基因工程方法构建高GPx活性的含硒抗氧化酶[D];吉林大学;2008年

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 赵斌;硒对大豆生理生化与产质量影响的研究[D];内蒙古农业大学;2006年

  本文关键词：硒蛋白K对T淋巴细胞免疫应答影响的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：257296