产单核细胞李斯特菌iap基因的克

发布时间：2020-02-15 08:45

【摘要】： 李斯特菌是一种分布非常广泛的革兰氏阳性兼性胞内细菌,在绝大多数食品中都存在。李斯特菌可引起严重的血液和脑组织感染。毒力因子的研究对于了解它的致病机制以及快速诊断均具有重要意义。iap (invasion associated protein)基因编码的p60蛋白是由李斯特菌产生的胞外蛋白,它对于该菌的分裂必不可少,并与该菌的侵袭性密切相关。在李斯特菌属的七个种中,两个种为病原种,即产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)和伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)。产单核细胞李斯特菌是重要的食源性人兽共患病原菌,而伊氏李斯特菌则会感染反刍兽,给畜牧业生产带来损失。本文的研究目的是:(1)以iap基因为基础,用大肠杆菌表达系统高效表达其融合蛋白;(2)建立PCR体系,用于高效、快速、可靠地检测李斯特菌属以及区分其中的两个致病种-产单核细胞李斯特菌和伊氏李斯特菌;(3)对扬州地区市场食品中致病性李斯特菌的污染率进行初步的调查研究。 1.产单核细胞李斯特菌iap基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 本研究对产单核细胞李斯特菌iap基因进行PCR扩增,将其重组到原核表达载体pET 30a(+)和pGEX 6p-1中,重组质粒分别命名为pET 30a(+)-iap和pGEX 6p-1-iap。然后将这两种重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和BL21。获得的重组菌BL21(DE3)(pET 30a(+)-iap)和BL21(pGEX6p-1-iap)经IPTG诱导及表达条件的优化后,SDS-PAGE结果表明,iap基因成功的获得了表达。其表达产物经超声波裂解,高速离心分离上清和沉淀,分别进行SDS-PAGE分析,结果显示BL21(DE3)(pET30a(+)-iap)和BL21(pGEX6p-1-iap)的表达产物p60蛋白为部分可溶性蛋白。过柱纯化之后的产物浓度分别为2.6mg/ml和1.8mg/ml。得到带有两种不同标签的可溶性的iap基因产物p60重组蛋白,为进一步研究p60蛋白提供了材料。 2.致病性李斯特菌PCR快速检测方法的建立 致病性李斯特菌在环境中广泛存在,且存在共生现象,并且两种致病性李斯特菌的危害对象并不相同。建立快速而有效的方法鉴定致病性李斯特菌以及区分产单核细胞李斯特菌和伊氏李斯特菌在科学研究与疾病控制方面都非常有必要。本研究利用李斯特菌属特异性毒力因子iap、溶血性李斯特菌特异性毒力因子hly和产单核细胞李斯特菌特异性毒力因子inlB,建立了基于聚合酶链式反应的检测体系,用于高效、快速、可靠地检测李斯特菌以及区分其中的两个致病种即产单核李斯特菌和伊氏李斯特菌。PCR体系可检测到3.46pg伊氏李斯特菌DNA和3.93pg产单核细胞李斯特菌DNA。对16小时LEB增菌培养的模拟污染生猪肉、水和牛奶的增菌培养液用PCR检测,结果检测限达10CFU/10克生猪肉、10CFU/10ml水或牛奶。 3.食品和环境中致病性李斯特菌污染率调查研究 为了解扬州地区致病性李斯特菌即产单核细胞李斯特菌和伊氏李斯特菌在各类食品及市场环境样品中的污染情况。自2007年2月-2007年4月采集扬州地区三个农贸市场(A、B、C)的各类食物样品630份,市场环境污水样品190份,采用增菌培养、选择性培养和PCR鉴定方法对上述820份样品进行致病性李斯特菌的分离鉴定。结果显示,农贸市场A、B、C的各类食物样品和市场环境污水Lm的平均污染率为1.34%,其中污染率最高的是市场B的猪肉样品,达3.75%,污染率最低的为市场A的污水和海产品以及市场B和C的蔬菜样品,污染率均为0%。统计学结果显示各市场生肉样品Lm的平均污染率(2.92%)要显著高于其它食品中的污染率。三个农贸市场820份样品中,市场B和市场C的海产品淡菜中各检出1份伊氏李斯特菌阳性样品,阳性率为0.24%,其中污染最严重的是市场B的海产品,污染率达1.43%,其余样品污染率均为0%。此外,两份伊氏李斯特菌阳性样品均存在两种致病性李斯特菌混合污染,其余样品中未检测到混合污染。从上述结果可以看出:(1)扬州地区各类食物样品以及市场环境污水存在不同程度的致病性李斯特菌污染;(2)新鲜猪肉比其它食品更适合Lm的生长或传播;(3)伊氏李斯特菌在海产品中偶见污染,值得注意。以上结果为食品安全措施的制定提供了科学的依据。
【图文】：

inlBInlB和InlA在基因上同被一个操纵子调控，并且在产单核程中也起着非常重要的作用[18]。此外，InlB的作用范围较InlA紧密地锚定在细胞膜上，而是通过被称为GW结构域的部分和它和InlA同属于内化素家族，在其氮端也具有一个富含亮氨酸单核细胞李斯特菌进入细胞的过程中起着关键的作用[20]。InlB子（HGF）的受体Met，HGF是一种酪氨酸激酶受体，它广泛胎盘，它同时也是一种能够引起肿瘤病变的原癌基因。值得一的天然配体肝细胞生长因子在结构上并不一样，事实证明，肝InlB与Met结合，因为InlB和肝细胞生长因子在Met上结合的位图 1. InlA 所产生的内化作用的示意图Fig1. The pathway of InlA

3.1.3 iapiap(invasion associated protein)基因编码 p60 蛋白，p60 是由李斯特菌产生的胞外蛋分子质量为 60KDa，由 484 个氨基酸残基组成的多肽链，它含有一个 Thr-Asn 的重复区域，具有水解酶和酰胺酶活性。通常 p60 蛋白于细胞表面产生，并大量分泌到生长中,在对某些缺失 iap 基因的李斯特菌变异株的研究中表明，它对于该菌的分裂是必不的，并与该菌的侵袭性有密切关系[24]。分析 p60 蛋白编码基因的突变体显示，对于 L吞噬细胞溶解作用以及对机体的感染过程，p60 蛋白是一个重要的因素。iap 基因的表受 PrfA 转录调节因子的调节，对于 iap 基因的表达调节发生在转录后的水平上。目前到的所有李斯特菌都含有 p60 蛋白或其同系物。但不同种的李斯特菌编码的 p60 蛋白 和 C 端区域都具有高度的保守性，不同种 p60 的中间区域各具特异性，这些特异性可图 2. InlB 所产生的内化作用的示意图Fig2. The pathway of InlB
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R378

【参考文献】

相关期刊论文 前5条

1 王颖,李洁,陈敏,顾其芳;李斯特菌食物中毒的流行现况及其对策[J];上海预防医学杂志;2000年04期

2 顾振华;食品中李斯特氏菌研究进展[J];上海预防医学杂志;2001年03期

3 赵巍,苏川,吴海玮,胡雪梅,沈蕾,王荣芝,马磊,陈淑贞,张兆松;重组质粒pGEX-6P-1/Sj-FABPc的构建及在大肠杆菌中的表达[J];中国血吸虫病防治杂志;2000年05期

4 陈森，辛显桐，，金蓉培;食品中单核细胞增生性李斯特菌及其快速检测[J];中华预防医学杂志;1995年01期

5 周晓辉,焦新安;产单核细胞李斯特菌的分子鉴定与亚分型研究[J];中国人兽共患病杂志;2003年05期

本文编号：2579771