两个新型Rab蛋白的分子克隆和生物学功能研究

发布时间：2020-03-24 21:36

【摘要】： 树突状细胞（Dendritic cells，DC）是近年来免疫学的研究热点之一，从中寻找新分子不仅有助于了解抗原提呈过程及免疫调节机制，而且可能有利于某些生物学机制的探讨。对cDNA文库的随机测序可以获得新的分子，同时对这些新分子的进一步功能研究将促进人们对某些生命现象的重新认识。本文所研究的hRabJ （human Rab protein with J domain）是从人DC的cDNA文库中发现的Rab家族的新分子；而在此讨论的mRabJ（mouse Rab protein with J domain）则是以小鼠睾丸 cDNA为模板克隆得到的hRabJ的小鼠同源物，与hRabJ在序列及生物学功能上具有极大的相似性。Rab蛋白是一类属于Ras超家族的小分子量GTP结合蛋白，自身具有微弱的GTP酶活性，分子量在22—25KD之间。目前认为，通过GTP与GDP 的开关转换作用发挥介导囊泡锚着与融合的功能，因此，对于蛋白的内吞和外吐等蛋白转运过程发挥重要的调控功能。新的Rab分子的发现，必将有助于蛋白转运这一重要生物学现象的研究。 RabJ的EST是在对人DC cDNA文库中大规模测序中发现的，，然后通过5' RACE获得了全长基因的编码序列。利用DC的反转录产物为模板，我们克隆了RabJ 的全长cDNA（已经在GenBank登录，基因登录号为AF178983），并将其用于以后的载体克隆。hRabJ cDNA全长1787bp，开放阅读框822bp，编码273个氨基酸的蛋白质。同源搜索提示其含有两类蛋白的特征性功能域。在其氨基端含有三个磷酸/镁离子结合基序和三个鸟苷酸结合功能域，是Rab蛋白家族分子结合GTP及发挥GTP酶活性的保守结构；羧基端含一个70氨基酸残基的J功能域，并且含有保守的与Hsp70家族分子相互作用有关的HPD序列。因此，我们命名其为hRabJ （human Rab protein with J domain）。人类组织Northern印迹发现hRabJ优势表达于睾丸组织，在卵巢和大脑中仅有极少量的表达，提示其可能参与生殖过程；在多种细胞系内我们检测到了hRabJ RNA的少量表达。RT-PCR提示hRabJ广泛低水平表达于多种常见T淋巴细胞、B淋巴细胞及单核巨噬细胞系。由于hRabJ在睾丸组织内的高表达，我们用小鼠睾丸反转录产物为模板，以hRabJ的两端引物为引物，克隆得到了hRabJ的小鼠同源物，我们将其命名为mRabJ（mouse Rab protein with J domain）。hRabJ与mRabJ在蛋白水平上有97％的同源性。Northern印迹显示mRabJ 也主要表达于睾丸组织，在小鼠的脑、心脏和骨骼肌中也检测到少量的表达。为了研究RabJ的功能，我们构建了多种原核及真核表达载体，包括GST融合表达载体、氨基端和羧基端GFP融合表达载体以及无融合真核表达载体等多种载体。而且利用pcDNA3.1-hRabJ中含有的新霉素选择标记，我们筛选出了稳定表达hRabJ的293 细胞株（hRabJ-293），并用于亚细胞分步裂解及共聚焦显微镜的定位研究。首先我们利用GST原核蛋白表达系统，在大肠杆菌BL21内表达并纯化得到 Abstract 了 GST—hRabJ活性融合蛋白。用（aF‘勺 GTP作为标记，我们证明纯化所得的融合蛋白体外能够特异结合GTP，该作用不能被小牛血清白蛋白（BSA人ATP所阻断，但是未标记的 GTP、GDP和 GTP类似物 GTP Y S可以阻断这种结合作用；通过检测不同时间点的放射活性，我们得到T GST－bRabJ的 GTP动态结合曲线，证明其最大结合能力约为 9 pmol／mg蛋白，稍高于其它已知的 Rab家族成员。用（Y－ P’勺 GTP为标记，我们得到7 hRabJ的酶活性曲线，与其它已知的 Rab家族成员类似。然后我们用纯化所得GST．hRabJ蛋自多次免疫家兔，获得了高亲和力的抗体，并利用野主型 BLZI裂解液及蛋白 A亲和层析纯化得到了特异性抗体。用 Western 蛋白印迹检测，我们证明该抗体是特异的，在（hRabJ－293）中只有一条带，可以识别m RabJ，而且不与多种Rab家族分子及DnMSp40家族分子发主交叉反应；用免疫荧光显微镜，在形态学上与GF P多抗所检测的结果一致。利用该抗体，我们检测了hRabJ在细胞系及寒丸组织中的蛋自表达水平。结果提示，除了在晕丸组织中有少量表达夕卜，各种细胞系中均未检测到RabJ的表达。细胞内荧光标记后FACS 检测也没有发现阳性表达的细胞系。为了研究＊劝J在睾丸组织内的分布，利用间接标记的免疫组织化学技术，我们发现二者在冰冻人与小鼠睾丸切片中均表达于生精上皮细胞上，提示RabJ可能参与精子细胞的产生。因此，RabJ是一个优势表达于睾丸组织的新型Rab分子。 Rab家族分子的一个非常显著的特点是其分布的特异性，即每一个分子都具有其各自的亚细胞分布，并在局部发挥蛋自转运的功能。因此我们利用生物化学方法及
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：R346

【共引文献】