人胰岛素原基因在小鼠乳腺中特异性表达

发布时间：2020-03-25 13:09

【摘要】：人胰岛素(Human insulin)是人胰岛β细胞分泌的一种蛋白类激素，目前的市场需求很大，而市售的胰岛素多为动物胰岛素。本研究就是探讨人胰岛素在动物乳腺生物反应器生产的可行性。研究用高保贞Taq酶通过PCR方法从正常人的基因组DNA中扩增出1182bp的人胰岛素原基因，运用TA克隆的方法将扩增片段插入PGEM-T-easy载体中，在Genebank中全序列分析表明扩增出的hINS与其中一个发表序列完全吻合，而与另外的一个发表序列同源性为99％，不同的碱基其中一处是位于内含子，其它三处位于等位多变点，这种碱基的差别可能与取样的人种有关。为了进一步验证扩增出的hINS基因能否在蛋白质水平上表达，用构建的乳腺特异性表达载体制作转基因小鼠，利用转基因小鼠作为个体表达系统来检测目标蛋白表达量。用高保贞长Taq酶通过PCR方法扩增出牛αS1-casein基因的6.4kb的5’端上游调控序列(包括第一外显子，第一内含子，第二外显子起始翻译密码子前的部分和5’端上游约5kb非翻译区)和1.5kb的3’端(紧接αS1-casein最后一个外显子下游的1.5kb非翻译区)，将它们按照止确的顺序连接，然后把测序正确的hINS基因序列克隆进αS1-casein基因的5’端和3’端之间，验证其为止方向插入。构建的乳腺特异性表达载体去除原核部分(αS1-casein基因调控序列+人胰岛素原基因)，显微注射小鼠受精卵雄原核，获得29只G_0代小鼠，PCR检测出其中8只为转基因刚性小鼠。检测出的PCR阳性小鼠剪取尾巴提取基因组DNA，Xhol酶切消化基因组DNA，电泳转印，用从测序正确的质粒中酶切纯化出探针，进行Southern-blot，结果其中1只小鼠Southern-blot检测呈阳性。转基因小鼠自然泌乳以后，收集到5只转基因小鼠和2只阴性小鼠的乳汁，脱脂脱酸以后，在乳清中用放射免疫检测方法检测胰岛素的表达量，结果其中两只转基因小鼠的表达量明显高于其它小鼠，表达量达到250uIU／ml和376uIU／ml，进一步的蛋白质定性和活性检测正在继续进行中。
【图文】：

酶切电泳,电泳,PCR扩增,产物

一人腆岛索原基因克隆，，鉴定1.PCR反应产物大小鉴定PCR反应经过条件摸索，在退火温度为62℃时，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果扩增出预计大小的l.Zkb大小的DNA条带(见图2-1)，凝胶电泳表明扩增效果较好，无非特异性条带出现。回收条带，纯化后，准备连接用。2，重组质粒的筛选及酶切鉴定将PGEM一Teasy载体和PCR产物连接重组质粒用xhol酶切、消化，产物经过0.8%琼脂糖凝胶电泳分析，筛选出含有人胰岛素原基因的重组克隆。酶切产物的电泳(如图2.2)表明，用Xhof酶切可以切出1.2kb的片段和3.Okb载体，证明所挑选的的克隆为正确的重组体

电冰,酶切电泳,质粒,条带

3.1牛asl一easein基因5’端和3’端UTR连接鉴定将牛aSI一easein基因5’端和3’端连接后重组的质粒(PssT)经Xho卜Sall酶切出现9.4+l.6kb证明发生重组，而用Notl酶切出现8.0+3.Okb条带则证明为正方向插入(如图2一7)。图2一7PSST质粒酶切鉴定电泳FigZ一7:TheeleetrophoresisfordigestionPSSTPlasmidbyrestrieten到meM:入一EeoT141digestMarkerl:PSST质粒Xhol+Sall酶切出9.4+1.6kb条带2:PSST质粒Notl酶切出8.0+3.okb条带3.2胰岛素原基因(h俐S基因)插入到调控序列鉴定将调控序列与人胰岛素原基因(hINS基因)连接重组质粒用Xhol酶切出1.2kb条带证明为目的基因插入，而用PvuH酶切如果切出2.9，2.55，4.7+2.Okb条带就证明插入的方向正确。命名为Psl(如图2一8，2一9)图2一SFSI项权醉切电冰FigZ一8:TheeleetrophoresisPlasmidbyXholrestrictenZymeM:入一EeoT141digestMarkerl:PSI质粒Xhol酶切出l.ZkbfordigestionPSI条带图2一9Psl质粒酶切电泳FigZ一6:TheelectrophoresisfordigestionpSTPlasmidbyPuvllrestrietenZymeM:人一EeoT141digestMarkerl:PSI质粒Puvll酶切出4.7+2.okb条带
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：Q78

【引证文献】