人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白的优化表达

发布时间：2017-03-22 12:11

  本文关键词：人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白的优化表达，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景人乳头瘤病毒(HPV)感染引起子宫颈癌等多种人类肿瘤。HPV基因型众多,且彼此间缺乏有效免疫交叉保护。国际上现有疫苗价格昂贵,目前在我国仍无疫苗可用。研究目的基于大肠杆菌和毕赤酵母表达系统,探讨不同策略对于优化HPV L1蛋白表达的影响,为研发针对多型别HPV的低价、广谱疫苗提供基础。研究方法在大肠杆菌中,采用非融合与不同融合蛋白形式,不同基因型HPV HPV16、18和58)L1序列,以及同一型但不同基因序列特征(包括哺乳动物细胞表达优化序列P16、野生型序列W16、及两个不同版本酵母表达优化序列M16和Y16)等策略,构建不同的重组表达质粒,并转化不同遗传背景宿主菌,在不同温度下进行诱导表达。在毕赤酵母中,采用不同序列特征的基因(即M16、Y16、W16和P16)、通过pPink-HC和pPink-LC质粒载体筛选高拷贝或低拷贝表达克隆、转化不同蛋白酶缺陷遗传背景宿主细胞、构建N端GST融合或C端截断形式基因,利用酿酒酵母α-因子信号肽引导分泌表达等多种策略,探讨提高HPV16 L1表达的有效方法。研究工作分析了不同基因序列mRNA的密码子特征、自由能以及GC含量,以SDS-PAGE及Western blot分析L1蛋白表达水平及可溶性,并以电镜观察病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)的装配。研究结果在原核表达系统,经酵母偏爱密码子优化的HPV 16、18、58 L1蛋白在GST融合形式下获得了高效的相似水平的表达；HPV 16 L1非融合或硫氧还蛋白融合未见明显表达；在遗传背景不同的宿主菌DH5 α与BL21中表达水平无明显区别；37℃诱导的重组蛋白以包涵体形式存在,而20℃诱导下,部分蛋白以可溶性形式存在；不同序列特征的HPV 16 L1基因获得了类似的表达水平。在毕赤酵母表达系统中,与野生序列相比,密码子优化显著提高了HPV16 L1的表达水平；N端GST融合与α因子修饰以及C端截断基因形式未明显改变表达水平；值得注意的是,基于哺乳动物细胞密码子优化的基因序列P16,同样获得有效表达；此外,毕赤酵母密码子优化序列M16与Y16表达水平相当,但M16显示了较好的可溶性和VLPs装配能力,而Y16可溶性极差；序列分析表明Y16和M16有5个氨基酸的差异。研究结论在大肠杆菌中,融合蛋白及诱导表达温度显著影响L1蛋白表达与折叠,而密码子偏爱等基因序列特征无明显影响。在毕赤酵母中,密码子优化是改善异源基因表达的有效手段,但mRNA二级结构可能随之变化并发挥重要影响；宿主菌蛋白酶缺陷对HPV L1蛋白稳定性具有显著促进；少数氨基酸变异可造成L1蛋白显著不同的可溶性及VLPs装配效率。本研究为有效制备HPV L1 VLPs、研发多型别HPV疫苗提供了基础,同时也为异源基因的重组表达优化提供了有益借鉴。
【关键词】：大肠杆菌 毕赤酵母 密码子优化 表达 人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一章 前言10-16
• 1.1 人乳头瘤病毒简介10
• 1.2 HPV的一般情况及生活周期10
• 1.3 HPV感染的危害性10-11
• 1.4 病毒样颗粒及VLP疫苗11
• 1.5 HPV预防性疫苗研究进展11-13
• 1.6 HPV疫苗制备常用表达系统13-15
• 1.6.1 原核表达系统13
• 1.6.2 酵母表达系统13-14
• 1.6.2.1 酿酒酵母表达系统13-14
• 1.6.2.2 毕赤酵母表达系统14
• 1.6.2.3 汉逊酵母表达系统14
• 1.6.3 昆虫杆状病毒表达系统14-15
• 1.7 本课题主要研究内容、目的及意义15-16
• 第二章 实验材料与方法16-44
• 2.1 材料16-25
• 2.1.1 质粒及菌株16
• 2.1.2 主要试剂16-18
• 2.1.3 主要仪器18
• 2.1.4 常用试剂配制18-25
• 2.2 实验方法25-44
• 2.2.1 密码子优化人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1(HPV L1)在大肠杆菌中的表达25-33
• 2.2.1.1 引物设计与PCR扩增HPV L1目的基因25-28
• 2.2.1.2 HPV 16L1非融合及Trx融合表达重组质粒的构建28-31
• 2.2.1.3 HPV L1 GST融合表达质粒的构建31-32
• 2.2.1.4 HPV L1融合蛋白37℃培养条件下的诱导表达32-33
• 2.2.1.5 表达产物的分析与鉴定33
• 2.2.2 不同密码子优化HPV16基因序列在毕赤酵母中的表达33-44
• 2.2.2.1 HPV16L1不同基因序列的分析33
• 2.2.2.2 重组质粒的构建33-35
• 2.2.2.3 重组质粒的鉴定35-40
• 2.2.2.4 重组质粒转化酵母感受态细胞40-41
• 2.2.2.5 HPV16L1在毕赤酵母中的表达41-42
• 2.2.2.6 表达产物的分析与鉴定42-43
• 2.2.2.7 HPV16L1重组蛋白和病毒样颗粒(VLPs)的初步纯化和电镜观察43-44
• 第三章 实验结果44-66
• 3.1 HPVL1基因在原核表达系统中的构建、表达与鉴定44-49
• 3.1.1 PCR产物及重组质粒鉴定44
• 3.1.2 不同融合形式HPV16 L1蛋白的表达44-46
• 3.1.3 不同宿主菌对HPV L1-GST融合蛋白表达的影响46-47
• 3.1.4 基因的不同核苷酸序列特征对HPV16 L1表达的影响47-48
• 3.1.5 不同基因型HPVL1蛋白的GST融合表达48
• 3.1.6 不同诱导培养温度对表达的融合蛋白可溶性的影响48-49
• 3.1.7 小结49
• 3.2 不同密码子优化HPV16L1基因序列在毕赤酵母中的构建、表达与鉴定49-62
• 3.2.1 HPV16L1不同基因序列的分析49-52
• 3.2.2 PCR体外扩增HPV16 L1基因以及重组质粒酶切鉴定52-56
• 3.2.2.1 PCR扩增HPV16L1基因结果52-53
• 3.2.2.2 PCR产物及载体的酶切和回收53-54
• 3.2.2.3 重组质粒的酶切鉴定54-56
• 3.2.3 不同密码子优化HPV16L1基因序列在毕赤酵母中的表达56-59
• 3.2.3.1 HPV16L1基因序列M16、Y16、P16、W16在pPink HC中的表达56
• 3.2.3.2 比较HPV16L1基因序列M16、Y16、P16、W16在pPink HC和pPinkLC中的表达56-59
• 3.2.4 不同蛋白酶缺陷、融合及截断形式对HPV16L1基因在毕赤酵母中表达的影响59-60
• 3.2.4.1 HPV16L1重组质粒Y16HC在pPink Strain1、2、3、4中的表达59-60
• 3.2.4.2 HPV16L1不同融合及截断形式的表达60
• 3.2.5 HPV16L1不同基因序列表达产物的可溶性分析和病毒样颗粒的组装能力的对比60-62
• 3.2.6 小结62
• 3.3 讨论62-66
• 展望66-68
• 参考文献68-73
• 致谢73-74
• 作者简历74-76

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 赖年钰;喻W

本文编号：261496