小肠蔗糖酶的分离纯化及部分性质

发布时间：2020-04-05 14:36

【摘要】： 对猪小肠蔗糖酶(Sucrase，E.C.3.2.1.26)在分离纯化的基础上，对其性质进行了初步研究。将猪小肠匀浆后的粗提取物进行分段盐析、DEAE-Sepharose柱层析及Sephacryl S-200、Sephadex G-200凝胶过滤等纯化步骤，得到聚丙烯酰胺凝胶电泳为单一蛋白区带，比活力为1.79units／mg蛋白的酶制品，经12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为一条区带，该酶的亚基相对分子质量为51000。等电聚焦显示其等电点(pI)为6.7。氨基酸组成分析表明：猪小肠蔗糖酶由约477个氨基酸残基组成，富含甘氨酸、谷氨酸、亮氨酸、门冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸、脯氨酸。圆二色谱(CD)对其二级结构的分析显示，蔗糖酶分子中α-螺旋占28.8％，β-折叠占27.9％，无规则卷曲占43.2％。通过动力学方法测得该酶的最适pH值为6.9，最适温度为50℃，以蔗糖为底物的米氏常数K_m为18.9mmol／L。该酶在40℃以下时比较稳定。用化学修饰法测得该酶的功能基团是半胱氨酸的巯基，对氯汞苯甲酸(PCMB)对蔗糖酶的抑制作用为反竞争性抑制，其抑制常数K_i为0.75mmol／L。二巯基苏糖醇(DTT)修饰，NR／R单向SDS-PAGE、NR／R双向对角线SDS-PAGE的结果均表明蔗糖酶分子内没有二硫键存在。各种金属离子对该酶的影响表现为：K~+、Fe~(2+)、CO~(2+)、Al~(3+)及Sb~(3+)对蔗糖酶活力影响不大；Zn~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)对蔗糖酶活力有不同程度激活作用，其中Zn~(2+)的激活作用最强：Li~+、Ni~(2+)、Ca~(2+)、pb~(2+)、Cd~(2+)、Hg~(2+)、Ag~+、Cr~(3+)及EDTA对蔗糖酶活力则有不同程度的抑制作用，其中Ag~(+)的抑制作用最强。在这些金属离子中，过渡金属离子Ni~(2+)、Mn~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、和Zn~(2+)在低浓度时对蔗糖酶有不同程度激活作用，随离子浓度增大，，Zn~(2+)激活作用明显加强，在含5mmol／L Zn~(2+)的反应体系中酶活力为140％；Mn~(2+)、Co~(2+)激活作用增加不明显；Ni~(2+)表现出轻微抑制作用；而 CU卜在随其浓度上升过程中对酶活力的作用却表现为先激活后抑制，在含 lmmol／L CuZ”的反应体系中酶活力增加了 13石％，在含 3mmol／L Cuy 的反应体系中酶活力基本没有改变，在含 smmol几 Cuy的反应体系中酶活力被抑制了 41．7％。重金属离子 Ag＼ Hgh、Cd卜对蔗糖酶活力的抑制作用随离子浓度增大而增加，smmol几 Ag“可完全抑制蔗糖酶的活性。 EDTA对蔗糖酶活性的抑制作用随其浓度增加呈线性增加。中药材中苍术、桔梗、桑白皮、知母、五味子、麦冬、桑叶、淫羊霍、丹皮、白术、乌梅、黄精、地黄、苍耳于、玉米须、冤丝子、玄参、泽泻和玉竹的75％乙醇提取液对蔗糖酶有不同程度的抑制作用，其中苍术、桔梗、桑白皮提取液的抑制作用较强，0．lmllo％苍术、桔梗、桑白皮75％乙醇的提取液分别使酶活力下降了刀刀％、52．7％和52．6％；仙鹤草、女贞子、天冬、石膏、人参和获菩的75％乙醇提取液对蔗糖酶活力影响不大；花粉、地骨皮、红参、黄蔑、三七、山药、黄莲和丹参的75％乙醇提取液对蔗糖酶有不同程度的激活作用，其中丹参的激活作用最强，0刁ml 10％丹参的75％乙醇提取液使酶活力增加了41％。调味料中大蒜对蔗糖酶有轻微激活作用，姜和花椒对蔗糖酶的活力影响不大，而辣椒和胡椒则有不同程度的抑制作用。其中胡椒碱对蔗糖酶的抑制作用随浓度增加而明显加强。当其浓度达到smmol几时，蔗糖酶活力仅剩余 12．7％。背角无齿蚌多糖对蔗糖酶有很强的激活作用。且随其浓度增加，激活作用加强。当其浓度达到sing加l时，蔗糖酶活力高达225％。
【学位授予单位】：四川大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：Q55

【引证文献】