Adeno-X Tet-On System转染体外培养乳鼠雪旺细胞的相关实验研究

发布时间：2020-04-06 07:57

【摘要】：周围神经损伤后，局部发生华氏变性，雪旺细胞增生活跃，合成分泌细胞表面粘附分子(CAMs)、细胞外基质复合物(ECM)以及多种神经营养因子，在神经修复过程中发挥了重要作用。因此关于雪旺细胞的相关研究日益得到重视。关于雪旺细胞研究的第一步就是雪旺细胞的体外培养，所面临的主要问题就是如何在解决成纤维细胞污染的同时促进雪旺细胞增殖。自上世纪七十年代至今，关于雪旺细胞体外培养的方法例如酶消化法、组织块法、抗有丝分裂法等逐渐发展成熟并得到广泛应用。这些方法均能够有效的去除成纤维细胞以及促进雪旺细胞增殖。但是随着研究的深入，对雪旺细胞纯度的要求越来越高，单凭某一种培养方法已难达到要求，而常常需要将多种方法联合运用以期在短时间内获得数量多、纯度高、状态好的雪旺细胞。虽然雪旺细胞可以通过分泌大量的神经营养因子促进损伤神经修复，但是由于所分泌的诸多因子在体内并不稳定并且容易第四军医大学硕士学位论文降解，因此对于神经修复过程来说仍显不足。基因转染可以解决这个问题。将编码神经营养因子的基因片断通过载体导入雪旺细胞即可以实现目的基因的持续、稳定表达。目前用于实验研究的载体有很多，，其中腺病毒载体以其滴度高、可感染分裂期及非分裂期宿主细胞以及病毒基因组并不整合到宿主染色体等特点而得到重视。本实验通过联合应用多种雪旺细胞体外培养方法获得高纯度的雪旺细胞，然后将携带有LacZ基因的整合了四环素调控框的重组腺病毒载体转染雪旺细胞，在诱导物存在下检测目的基因的定性及定量表达。探讨了应用整合有四环素调控框的重组腺病毒载体系统携带治疗基因转染雪旺细胞以促进损伤神经功能恢复的可行性。本实验分为以下几部分: 一、雪旺细胞原代培养。为了在短时间内获得数量大、纯度高、状态好的雪旺细胞，采取6一7天SD乳鼠坐骨神经，采用酶消化法、差速贴壁法分离获得雪旺细胞、Ara一C与G418联合应用以去除成纤维细胞、牛脑垂体提取物(BPE)以促进雪旺细胞增殖，以及采用低浓度胰酶消化法传代等一系列步骤。结果经形态学及S一100蛋白相关抗原免疫细胞化学染色鉴定证实所获得的雪旺细胞状态较好，纯度较高，可达90%以上。二、BPE对雪旺细胞促增殖作用的研究。探讨BPE对体外培养雪旺细胞增殖作用的影响以及确定BPE应用的最佳浓度。具体方法是:将第二代雪旺细胞分为五组，分别加入不同浓度的 BPE(50拌g/ml、1 00林g/ml、1 50卜g/ml、200拼g/ml)，并以不加BPE 作为对照。在加入BPE后于第二、四、六、八天每组分别作S一100 蛋白相关抗原免疫细胞化学染色，对雪旺细胞、成纤维细胞分别计数，进行统计学分析。结果显示BPE对雪旺细胞有明显促增殖作用;当BPE浓度为1 00件g/ml时，对成纤维细胞分裂影响较小同时对雪旺细胞保持了有效的促增殖作用。第四军医大学硕士学位论文三、腺病毒载体的体外扩增、滴度测定。为了对腺病毒载体系统Adeno一x Tet一on system进行扩增以供进一步转染体外培养雪旺细胞，将腺病毒载体感染HEK293细胞，待CPE现象明显时采用反复冻融法收获病毒，然后将收获的病毒再次感染HEK293 细胞，收获病毒，重复三次。对最后一次收获的病毒采用噬斑检测法(plaque assay)进行滴度测定，结果显示三轮扩增后Adeno一x Tet一On regulato汀 Virus和Adeno一X TRE一pgal Control Virus滴度分别为:l.26x logpfi刀ml;l.99xlogpfi刀Inl。四、Aden。一x Tet一on system转染雪旺细胞的研究。探讨将重组腺病毒载体Adeno一x Tet一OnS州em转染雪旺细胞后，在诱导物强力霉素(Doxyeyeline，DOX)存在下LacZ基因的诱导表达情况。采取以下方法:1.在DOx剂量确定的情况下(2林留ml)，使用不同滴度的病毒转染雪旺细胞，对基因表达产物p一半乳糖普酶 (p一galactosidase，p一gal)进行定量检测，对检测结果进行统计学分析，确定转染雪旺细胞的最适滴度。然后依据此滴度将腺病毒载体转染雪旺细胞，随着DOX浓度的变化，对p一gal的诱导表达进行定量检测、绘制诱导表达曲线并作定性鉴定。结果:当 M.o.x(multip一ieity ofinfeetion)=60 pfu/eell时即可获得p一gal的最高表达。通过诱导表达曲线可以看出随着DOX浓度的不断增加， p一gal的表达量也随之增加。但当DOX达到一定浓度后，p一gal的表达量不再随之增加，即已达最高表达量。通过以上实验，我们可以得出以下结论: 1.通过将酶消化法、差速贴壁法、Ara一C与G4 18、牛脑垂体提取物(BPE)、以及低浓度胰酶消化法联合运用可以在短时间内获得纯度高、状态好的原代培养雪旺细胞。 2.适当浓度的牛脑垂体提取物(BPE)可以有效的促进雪旺细胞增殖。 3.使用HEK293细胞扩增腺病毒载体、噬斑检测法(Plaque 第四军医大学硕士学位论文 assay)测定病毒滴度，可以在短时间内获得高滴度的腺病毒载体。 4.使用Adeno一X Tet一On System转染雪旺细胞，通过诱导剂可以实现目的基因的可调控、高效表达。为以后携带相关治疗基因转染雪旺细胞促进损伤神经修复奠定了基础。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R329.2

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