无精症相关基因ZNF230的转录调控研究与UBE2B基因的突变筛查

发布时间：2020-04-08 18:59

【摘要】：精子发生是一个多阶段，多步骤的持续细胞分裂和分化过程，它受到性染色体和常染色体上一系列基因的调控。研究表明：锌指蛋白基因家族作为哺乳动物最大的基因家族之一，参与了精子发生和成熟的各个阶段的表达调控。 本研究围绕精子发生相关基因的功能研究，共分为三个部分。 本课题组先采用mRNA差异显示获得了只在正常已育男性睾丸中表达的EST，然后通过cDNA末端快速扩增的方法分离克隆了1个新的锌指蛋白基因ZNF230，并根据其cDNA序列，用电子克隆和PCR相结合的技术克隆了小鼠的同源基因znf230。初步的研究表明ZNF230可能作为转录因子在精子形成过程起作用。本课题的目的在于进一步研究ZNF230基因表达的亚细胞定位及转录调控机制。 第一部分：首先用绿色荧光蛋白标记观察了人类无精症相关基因ZNF230在Cos7细胞中的蛋白质表达及定位。为此构建了ZNP230—荧光蛋白融合基因表达载体，然后经真核表达质粒—脂质体介导，将其导入Cos7细胞系。荧光显微镜观察显示：在空白载体pEGFP-N1转染的Cos细胞中荧光布满整个细胞，而在转染阳性载体pEGFP-ZNF230的Cos细胞中荧光主要聚集在细胞核中。表明转染的Cos细胞系能高效表达人 四川大学硕士学位论文 多1汽炙矽蛋白，表达的蛋白定位于细胞核内。 第二部分:为了从转录水平揭示ZNF23O基因的调控机制，首先克隆 了全长为1.Zkb的ZNF23O基因转录5’端上游的转录调控区片断。再用 ZNF230基因5’侧翼序列的各缺失片段与带荧光素酶报告基因的pGL3融 合构建了重组质粒。然后用这些携带报告基因的质粒转化HEK293细胞， 并测定了其瞬时表达的荧光素酶活性。结果表明ZNF230基因的基本启动 子元件位于转录起始位点上游一134至十149bp。该序列缺乏通用的TATA box，，但包含有一个位于一33bp处的Spl的结合位点，后者对于基础转录 起着重要作用。 为进一步确认SPI位点的功能，我们利用定点突变等技术确认了SPI 位点对于ZNF23O基础表达的重要性。上述研究结果为进一步阐明ZNF230 的转录调控提供了基础。 Soxs是一个与精细胞特异表达有关的转录因子。为了阐明它是否参 与了ZNF23O的转录调控，我们构建了重组Soxs真核表达载体，并用脂质 体介导将该质粒与含有ZNF230基因基本启动子元件的重组pGL一载体共 转染了培养的HEK293细胞株。结果发现转染了Soxs真核表达载体的荧 光素酶活性比单独转染PGL一3载体活性明显增加，提示Soxs蛋白可能参 与了ZNF23O精细胞特异的转录调控。 第三部分:精子发生相关的基因突变是导致原发不育的重要原因。 已知UBEZB对于精母细胞的减数分裂十分重要。为了阐明UBEZB基因在 原发无精症中的作用，我们在157例无精症和69例健康已育男性中用 DHPLC法对该基因全部外显子进行了突变筛查。结果在外显子3第二氨 基酸的位置筛查到1个A一G的核普酸变异，使精氨酸变为甘氨酸，但对 照组未发现该突变。后者的病理学意义正在进一步研究中。 关键词:无精症ZNF230 UBEZB基因转录调控 突变筛查变性高效液相色谱
【图文】：

A:pEGFP一Nl图2一3B:pEJp一ZNF230

C:pEGFp一znf230
【学位授予单位】：四川大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346

【共引文献】

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本文编号：2619712