EPEC粘附相关分子抗血清制备及其中和能力探讨

发布时间：2017-03-22 19:02

  本文关键词：EPEC粘附相关分子抗血清制备及其中和能力探讨，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:构建EPEC粘附相关分子Bfp A、Esp A和Intimin C300(羧基端300个氨基酸)原核表达载体,纯化相应蛋白并制备其抗血清,并探讨抗血清对EPEC粘附Hep-2细胞的影响。方法1.以EPEC标准株E2348/69全基因组为模板,设计引物,采用PCR扩增bfp A、esp A和intimin C300目的基因,并克隆到T载体;经双酶切鉴定后,亚克隆至表达载体p ET32a,获得重组表达质粒p ET32a-bfp A、p ET32a-esp A和p ET32a-intimin C300;基因测序正确后转化至表达菌BL21(DE3),构建工程菌BL21/p ET32a-bfp A、BL21/p ET32a-esp A和BL21/p ET32a-intimin C300。2.IPTG诱导工程菌BL21/p ET32a-bfp A、BL21/p ET32a-esp A和BL21/p ET32a-intimin C300表达目的蛋白,SDS-PAGE和Western-blot检测表达结果。3.通过Ni-柱亲和层析方法纯化目的蛋白,用纯化目的蛋白为抗原辅以佐剂免疫家兔,末次免疫1周后,用心脏采血的方式收集家兔血清,得到抗血清。对流免疫电泳检测其效价,玻片凝集检测抗血清和EPEC特异结合的能力。4.用不同稀释度的抗血清中和细菌,用未免疫的家兔血清做对照,显微镜观察细菌的粘附情况,从而判断抗血清对EPEC粘附Hep-2细胞的影响。结果1.成功构建EPEC粘附相关分子Bfp A、Esp A和Intimin C300原核表达载体p ET32a-bfp A、p ET32a-esp A和p ET32a-intimin C300,并构建了相应的工程菌BL21/p ET32a-bfp A、BL21/p ET32a-esp A和BL21/p ET32aintimin C300,工程菌都主要以可溶性形式表达目的蛋白,SDS-PAGE和Western-blot显示表达产物分子量分别约为42KD、41KD和54KD,与预期分子量相符。2.获得纯度较高的Esp A融合蛋白,但未能得到Bfp A和Intimin C300纯化蛋白,其纯化条件有待进一步摸索。3.获得Esp A抗血清,玻片凝集实验发现抗血清能有效结合EPEC,对流免疫电泳检测其效价仅为1:2,但中和实验发现抗血清在稀释倍数16以内皆能有效抑制EPEC粘附Hep-2细胞。结论:建立了EPEC粘附相关蛋白Bfp A、Esp A和Intimin C300原核表达系统,并通过Ni-柱亲和层析法有效纯化得到含有组氨酸标签的Esp A蛋白,用该蛋白免疫家兔,制备了相应的抗血清,虽然抗血清的滴度较低,但抗血清可以有效中和EPEC对Hep-2细胞的粘附,因此Esp A是EPEC抗感染免疫重要中和抗原。结果:
【关键词】：EPEC Bfp A EspA Intimin 原核表达 抗血清 粘附
【学位授予单位】：川北医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392-33
【目录】：

• 致谢4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 1 材料与方法12-25
• 2 结果25-36
• 3 讨论36-41
• 4 结论41-43
• 参考文献43-47
• 综述：致病性大肠杆菌（EPEC）粘附相关蛋白的研究进展47-57
• 参考文献53-57
• 附录57-59
• 个人简历59

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 黄庶识;卢明倩;李冰;周冰;陈丽梅;;重组大肠杆菌表达可溶性蛋白和包涵体过程的拉曼光谱实时分析[J];中国激光;2014年12期

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本文编号：261983