IKKα参与调控UVB刺激作用下p53诱导活化的胞内信号转导机制研究

发布时间：2017-03-22 20:10

  本文关键词：IKKα参与调控UVB刺激作用下p53诱导活化的胞内信号转导机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景紫外线(Ultraviolet radiation,UV)是一种典型的的环境损伤因素;根据波长大小可分为UVA(320-400nm)、UVB(280-320nm)和UVC(200-280nm)三种类型。其中UVB是诱导机体发生损伤效应的关键因素。UVB除了能够诱导VEGF、TNFα等一系列炎性因子分泌和诱导表达并介导炎性损伤效应外,还能够通过诱导p53活化并介导DNA损伤效应。我们的前期工作研究结果已经揭示了UVB诱导炎性损伤效应发生的分子机制,因此本论文着重讨论UVB诱导p53活化并介导DNA损伤反应的分子机制。随着IKK/NF-κB信号途径研究的不断深入,一些NF-κB和IκB非相关的新型IKK激酶底物分子被相继发现,提示负责启动IKK/NF-k B信号通路诱导活化的关键上游信号分子IKK激酶具有诱导NF-κB途径活化以外的新功能。IKKa作为IKK激酶的一个重要的催化亚基,它能够通过激活一系列NF-κB非相关的信号蛋白分子并以NF-κB非依赖方式参与多种生物学反应。本课题组长期从事IKKα不依赖于IKKβ和NF-κB的新功能机制研究,并在UVB诱导的细胞损伤反应模型中取得了一些研究进展。我们发现:IKKa能够不依赖于NF-κB调控UVB刺激作用下VEGF的诱导表达,并且介导了炎性损伤效应。目的探索IKK激酶催化亚基IKKa参与调控UVB诱导p53活化并介导DNA损伤反应的分子机制。方法采用双荧光素酶报道基因分析系统检测在UVB诱导细胞反应中p53的转录激活活性;通过Western Blot检测Hacat和MEFs细胞中p53ser15(人)/ser18(鼠)、ATR、ATM、CHK1、LKB1和PERK蛋白的表达;免疫共沉淀检测在生理状态下内源IKKα与ATR、ATM、CHK1、LKB1、PERK是否存在相互作用,通过流式细胞术探讨了p53与IKKα对凋亡反应的敏感性。结果1、我们发现UVB能够通过诱导Hacat和MEFs细胞中p53活化而介导促细胞凋亡效应,同时我们确定了IKKα在p53的诱导活化及促细胞凋亡反应中发挥关键作用。2、IKKα能够与经典DNA损伤信号途径ATR-ATM/CHK1之间发生功能联络并介导p53的诱导活化反应。期间,IKKα与CHK1发生相互结合反应是影响ATR-ATM/CHK1蛋白复合体形成的关键因素。IKKα基因缺失或功能障碍条件下,ATR和ATM无法结合CHK1,以上所有信号分子的诱导活化反应被抑制,因此造成p53活化反应受抑。3、IKKα也能够与能量代谢应激因子LKB1之间发生功能联络并介导p53的诱导活化反应。IKKα的存在是影响LKB1与p53形成蛋白复合体的关键因素。IKKα基因缺失或功能障碍条件下,LKB1无法结合p53并导致p53活化反应受抑。4、UVB能够诱导Hacat和MEFs细胞中PERK活化,并且IKKα还能够通过激活PERK介导p53的诱导活化反应。IKKα也可结合于PERK/p53蛋白复合体;但IKKα的存在并是PERK与p53之间发生相互结合作用的前提条件。结论1、揭示了IKKα/ATR-ATM/CHK1/p53信号通路在介导UVB诱导细胞损伤反应中的作用机制;2、LKB1是实现UVB刺激作用下IKKα调控p53诱导活化的另一关键信号传递分子;3、IKKα可以通过调控内质网应激反应进而实现诱导p53活化的信号转导机制。
【关键词】：UVB IKKα p53 ATR CHK1 LKB1 PERK
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 缩略词表11-12
• 引言12-16
• 第一部分 IKKα通过调控P53的诱导活化反应介导UVB引发的促细胞凋亡效应16-28
• 1 材料和试剂16-17
• 1.1 质粒及siRNA16
• 1.2 细胞系16-17
• 1.3 细胞生物学试剂17
• 1.4 分子生物学试剂17
• 1.5 其他常规试剂配制方法参考<<分子克隆实验指南>>17
• 2 实验仪器17
• 3 实验方法17-19
• 3.1 双荧光素酶报告基因分析17-18
• 3.2 免疫印迹（Western blot）分析18
• 3.3 PI染色与流式细胞术结合方法18-19
• 4 实验结果19-26
• 4.1 UVB诱导Hacat和MEFs细胞中p53活化并介导促细胞凋亡反应19-21
• 4.2 IKKα 参与调控UVB刺激作用下Hacat和MEFs细胞反应中p53的诱导活化反应及促细胞凋亡效应21-26
• 5 讨论26-28
• 第二部分 IKKα通过激活ATR-ATM/CHK1途径介导UVB诱导的P53磷酸化修饰反应28-40
• 1 材料和试剂28-29
• 1.1 质粒及siRNA28
• 1.2 细胞系28
• 1.3 细胞生物学试剂28-29
• 1.4 分子生物学试剂29
• 1.5 其他常规试剂配制方法参考<<分子克隆实验指南>>29
• 2 实验仪器29
• 3 实验方法29-30
• 3.1 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)29-30
• 4 实验结果30-39
• 4.1 UVB诱导Hacat和MEFs细胞中ATR、ATM、CHK1活化30
• 4.2 抑制ATR、ATM表达显著下调CHK1及p53的诱导活化水平30-32
• 4.3 抑制CHK1表达显著下调p53的诱导活化反应32-33
• 4.4 ATR-ATM/CHK1/p53信号途径中信号分子聚集体的形成33-34
• 4.5 IKKα调控ATR-ATM/CHK1/p53信号途径活化34-36
• 4.6 IKKα结合于ATR-ATM/CHK1/p53聚集体是其发挥功能的必须条件36-39
• 5 讨论39-40
• 第三部分 IKKα通过激活LKB1介导UVB诱导的P53磷酸化修饰反应40-48
• 1 材料和试剂40-41
• 1.1 质粒40
• 1.2 细胞系40
• 1.3 细胞生物学试剂40-41
• 1.4 分子生物学试剂41
• 1.5 其他常规试剂配制方法参考《分子克隆实验指南》41
• 2 实验仪器41
• 3 实验方法41
• 4 实验结果41-46
• 4.1 UVB诱导Hacat和MEFs细胞中LKB1的活化41
• 4.2 抑制LKB1活性显著下调p53的诱导活化水平41-42
• 4.3 LKB1/p53信号途径中信号分子聚集体的形成42-43
• 4.4 IKKα 调控LKB1/p53信号途径活化43-45
• 4.5 IKKα 结合于LKB1/p53聚集体是其发挥功能的必须条件45-46
• 5 讨论46-48
• 第四部分 IKKα通过激活PERK介导UVB诱导的P53磷酸化修饰反应48-58
• 1 材料和试剂48-49
• 1.1 质粒48
• 1.2 细胞系48
• 1.3 细胞生物学试剂48-49
• 1.4 分子生物学试剂49
• 1.5 其他常规试剂配制方法参考《分子克隆实验指南》49
• 2 实验仪器49
• 3 实验方法49
• 4 实验结果49-55
• 4.1 UVB诱导Hacat和MEFs细胞中PERK和p53的活化49-50
• 4.2 抑制PERK表达水平显著下调p53的诱导活化反应50-51
• 4.3 PERK/p53信号途径中信号分子聚集体的形成51
• 4.4 IKKα调控PERK/p53信号途径活化51-53
• 4.5 IKKα结合于PERK/p53聚集体是其发挥功能的必须条件53-55
• 5 讨论55-58
• 全文总结58-60
• 参考文献60-64
• 综述64-68
• 参考文献66-68
• 致谢68-70
• 攻读学位期间发表的学术论文目录及参与基金项目70-71

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本文编号：262132